msc消化时，细胞竟然没有变圆

caiyu07248

前两天做脐带MSC培养时，原代培养感觉长得还可以，细胞长到第三天已达到80%（如图），但是消化传代时，消化了5min，细胞还没有变圆，然后我又消化了5min，但是细胞还是没有变圆，我也不敢再消化了，就用枪吹打了几下，结果细胞都脱落下来，但是形状还是梭行的，并没有变圆，然后我就直接吹下来，收集离心，接种后，第二天大多数细胞都是悬浮的，贴壁的细胞很少，细胞应该是都死了吧。请各位大侠赐教，我的细胞时怎么啦？

lcw918

回复 caiyu07248 的帖子& y% Q" q  ?& j# a

7 Z$ r6 D6 h$ q% T2 a消化操作的问题，是不是操作前忘记PBS洗了，有残留的培养基会中和掉消化酶的。
* I1 X+ e8 I& j$ r; p如果悬浮了，应该死了，细胞状态好，可以试试把悬浮的倒掉只保留铁壁的

445334587

应该是加酶时没有洗去残留培养液，然后加入等体积生理盐水，避免酶直接作用于细胞，这样对细胞伤害降低，还有可以边消化边摇动瓶子，加快细胞脱落。

caiyu07248

回复 Donnies 的帖子  a/ b! z) c( M0 b8 r
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谢谢，我怀疑是消化液的问题，我后来用胰酶消化后，细胞消化形态也正常了，也正常贴壁了。

Donnies

应该是细胞都死了，是不是你的培养基换错了还是培养基已经放了很久了，这样的话细胞就是由于环境的不适合导致无法贴壁，另外有一个建议，细胞长2-3天之后，如果长到80%-90%即可传代，传四五次之后更换新的培养瓶。

caiyu07248

回复 yangwy028 的帖子. T% E) }! s/ s  J2 P* q

* H8 j: A; I% s) N3 ?* b' t从脐带中提取的MSC，原代培养到第三天时，细胞就是照片中的样了，漂浮着的是应该是血细胞，照片可能拍得不清楚，细胞也就大概长到80%。细胞长到80%时，吸弃上清，用DPBS洗了两遍后，加0.5ml的MSC消化液（不清楚是不是胰酶，以前都用这个没有出现问题），室温下5min,细胞没有变化，然后我就放于培养箱中又是5min,细胞还没有变圆，觉得不对劲，就加了DPBS用枪吹了几下，镜下观察发现，细胞都脱落了，但是还是有很多细胞形态是梭形的，没有变圆就直接从壁上掉下来了。我就直接吹落收集，离心，再接种，第二天大多数细胞都漂着，仅有少数的几个细胞有贴壁。

yangwy028

从图片来看楼主的细胞长得过密，而且这批细胞还貌似很不纯了。这样你的消化酶就无法有效的和细胞进行接触。其实并不是消化不下来，而是无法真正的接触并发挥作用。你的细胞是脐带的MSC吗？上边漂浮的是什么东西？你原代三天能长成这个样子么？请予以更详尽的描述。扔掉总结总结经验再换一批养吧。

small

消化时胰酶的温度也会影响细胞的消化，

deshenglll

部分细胞长过了是很难消化的，所以要及时的处理细胞。建议细胞融合度85%就要处理了。好像细胞状态不是很好啊。

jihaijie

贴壁细胞的培养常常在消化出问题,每次消化时间把握好,如果5分钟细胞还没有变圆,立即加入PBS,换用新的消化酶.否则你等半个小时,细胞状态就不好了.