DNA甲基化分析的心得---新人第一帖---求分，求谅解！！！

Andyhigh

最近在试着做DNA甲基化分的分析，希望和大家分享下！用的方法是亚硫酸氢钠法（BSP）; n2 S& Q, Y& ]( C  L9 f

# H  b* x+ M0 Z0 X/ i5 E3 S9 ^) {大致步骤：
6 Y: c. ]# v2 B0 S' w               & o# ^' y; `& o4 P# _
1.甲基化引物的设计-这是重中之重，直接关系到后面试验的成败，引物是别人帮我设计的。一些基本原则:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物 1 s3 K2 Z/ u: x! A! \6 C% R) O/ Y
   应包含尽可能多的CpG位点。附件里面也有一些资料, e8 T0 A4 b. }1 Q( {3 _# L* `9 f
2.DNA的提取，我用的是试剂盒，按照上面的步骤来的。
7 Q1 k4 J5 I: Q6 S9 L: }3.BS的处理：其中有一个很关键的地方就是BS处理的时间问题：太长会使目的片段断裂，然而时间太短会使变性不充分。经过不同时间处理梯度试验（4 8 12 16h），发现十六小时不错，  ' W0 g, }2 q5 }5 Y; y/ `; C0 g+ M
   我的目的片段在200bp左右。
, M% \, g9 q+ a; e2 }  b4.PCR的问题:对于不同目的基因的目的目片段Tm值有可能不一样，这也需要自己摸索。
, ?8 S' p& `. P# h5.琼脂糖凝胶电泳：基本原理及注意事项见附件) G0 R/ b5 U% ?5 P6 q4 d
6.载体构建和转染：用的也是试剂盒。
7 W" w0 d  p3 Z* R2 [; C; {- Q! N7.挑选单菌落:通过菌液PCR产物跑胶和小摇转染后的大肠杆菌，双重选择阳性克隆。' E+ ]. \" `$ v# z8 i; Y
8.测序和后续的结果分析6 X% p; n( h% u1 G; Z0 _
' l/ o1 l7 P; s% G
大致步骤就是上述的，求高手指点，尤其是那些做个的人，谈谈实验中应该注意的东东，自己是新人！！！

Andyhigh

Andyhigh

顶顶顶！！！

Andyhigh

引物设计软件：methyl primer express   送个premier  6.0吧
$ p2 I& X8 }4 p1 j7 q: o在线的引物设计http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html与http://www.urogene.org/methprimer/

妖妖空

师兄是做表观遗传学的吧。学校也有老师在做，不过对这方面的内容不是特别了解。好像有些论坛有专门的交流版块。

461650833

引物设计要特意。不然真的不好P。3 }7 r' S4 i' J+ q! f% R
如果用那个在线软件设计的引物P不出来，可以考虑设计一对外侧引物，用外侧引物P完后的产物做模版，在进行PCR，效果会好很多。8 |. D0 q6 n5 X/ M9 D) j

Andyhigh

回复 461650833 的帖子
: v# N2 Y) s; @3 c; ]+ ]7 o. g6 U5 q9 o
自己用的是巢式PCR（用两引物分别P两次）；昨晚测序结果出来了，但是测序样品异常，原因是菌液样品浓度低，未抽出质粒，取消测序。$ q# _- n" _9 V, I% |
' q/ J0 Y: X# @1 a+ I) T7 [
自己做的 菌液PCR  和      用含氨苄青霉素的培养基挑选的单菌落  应该能说明载体构建成功了，不知道是哪出了问题。4 Y+ {7 |6 e. a; x

; d% Y! v- ]' q今天跟别人请教了下，说可能是质粒丢失，建议我自己提下菌液的质粒（现在已经做好了，正在跑PCR，看能否有自己想要的条带）。  不过自己对菌液的质粒丢失不是很理解，忘高手指点。

Andyhigh

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3 u) j) v. Y  d% E/ K) i: j* [" X' o/ E9 P% w$ T
嗯  将来的工作会围绕表观遗传这一块的，能推荐几个好的论坛的专门交流板块嘛？？？如果你跟你老师熟的话，能顺便帮我问下嘛，谢谢啊！！！

Andyhigh

昨晚测序结果出来了，但是测序样品异常，原因是菌液样品浓度低，未抽出质粒，取消测序。
( {1 i" Q% i- d7 O' y8 j) p$ x' \: E3 }2 E2 C- B: S' r4 I2 Q
先把结果发给大家看看，希望过来人，帮我分析分析问题出在哪了！！！

食毕莫饥

甲基化比率不稳定怎么回事？哪位高手指点一下？