切质粒时的浓度

zhangtcm

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& Q# ?2 K: o9 ?, Q1mL的反应体系，太夸张了，改一下吧。

zhangtcm

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给你参考一下
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DNA分子的限制性内切酶消化/ |; {/ i! I* V& X

$ j3 p$ T5 l  B限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。( J/ E/ ?" O7 n2 k# @$ Q: U
一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案
6 D4 X4 n8 z, s6 X) \! [1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
6 }# F# u: g- D9 B0 X$ y2.20μl体积反应体系如下： # E: }$ l4 ]  W# \& R6 ]
DNA 0.2-1 μg
  L+ C& x3 a/ f& Z" |1 ^10×酶切buffer 2.0 μl
% q# h5 V5 M6 J8 Z; h$ h/ _限制性内切酶 1-2 u（单位）) t# A& O; v% v. U3 T
加ddH2O 至 20 μl. M  `- w' P& d& J5 @, \
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。
* `% y  s" t8 j8 n5 ^2 L: b. Q4 j3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。
; j0 ]$ X$ f0 |: P" C! O4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。
5 }5 k# T' e' j# E- U/ W0 T# R5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
; t3 K4 _% x3 J  C& i: P# m6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。
8 K# e% n" F! H( v( D" r! r7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。/ `$ V3 S: }* v$ ?' y9 V  P
二、电泳检测
& ?2 i& P* I$ i; L. S1 H# F' y取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。
1 @7 v+ k. k. B6 D1 \3 N4 q5 A9 a三、注意事项2 y- ~7 Y5 ?7 q+ q6 V5 K; q+ t6 }
1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。
, E! d; N1 L0 c( D1 J; h- g2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
2 H. K7 C9 A& u! L3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
- t  _9 d) l; E* g; T& I4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。% q# g- O! N* Z& U; m8 v) N" J
5.注意星号酶切活力。
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zhangtcm

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4 N0 u- E2 Y, u
你看一下说明书，它应该写明了酶切的最佳浓度，即切多少ug质粒，需要多少酶，体系成倍放大好了，直到你要的DNA毫克