切质粒时的浓度

mhqh

我用限制性内切酶切质粒，1mL的反应体系（总体积1mL，含酶、buffer、质粒和水），我切200μg的质粒DNA，这浓度是高了还是低了还是刚好？( Z6 k. E2 ^7 F: O' [

, ^" F! N6 {. t+ D另外，送的buffer好少好少啊，4,000 U 的酶（15 U/μl ），才送我500μL的buffer，那些buffer有叫10×H的，有叫10×M的，有叫10×K的，是不是可以稀释10倍用？是要刚刚好稀释10倍，还是要小于或等于10倍？

SSRSQ

你要用这么多的质粒干什么啊，一次切200微克。1000微升的体系切200微克浓度有点高，可以37度过夜。带的buffer很多的啊，10*就是10微升体系加一微升buffer，1ml反应体系才用100微升的buffer，通常buffer是用不完的。

86964109

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; s% h/ w3 [$ l5 d1 K. v1 q! z6 v! k" Y; v+ f& n
太夸张了吧 ，50μl体系一次切2μg足够了，2种酶各2.5μl，你用的是TAKARA的酶吧，10×H，10×M，10×K，是分别对应不同酶的需要的，分别对应不同盐浓度，一般什么颜色盖子的酶就用什么样色盖子的buffer，双酶切得看说明书或他们家产品目录上内切酶介绍选择共用buffer，打个比方如果你切50μl体系，那么除了质粒，酶 就加5μl 10*buffer，其余用水补

huangcong1988

你的体系是1ml？太吓人了，一般做酶切的话，体系是20μl吧？干嘛切这么多啊？我们20μl体系的话，浓度为1000ng每μl的质粒加1到2μl，然后酶加1μl（双酶切的话，一种酶加1μl），然后buffer加2μl，还有这个buffer要注意咯，buffer必须是两种酶活性最强时候用的buffer，其余的用水补足到20μl

zhangtcm

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1 z7 Z' Q# b4 N; b0 ^' Y7 l/ I& o' C
1mL的反应体系，太夸张了，改一下吧。

zhangtcm

回复 mhqh 的帖子1 N1 u: @7 v: o+ U& Q  @

! e% j$ a3 U% H. I: B/ j! _给你参考一下0 _+ W/ Z  a% O

" @: T- U+ ~) M  I: u! j1 ODNA分子的限制性内切酶消化! e8 c3 a3 p. ~* P  ~
/ x) B- A8 r$ e* R
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。. f' z2 A( B! Y+ D  H, u5 ^
一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案5 u) `) D8 W6 B9 s1 w
1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。) A. I3 ?+ F  Q$ U. p' w
2.20μl体积反应体系如下： ( i  m- ~) N$ l3 t7 f0 S/ _$ \
DNA 0.2-1 μg4 |3 z2 a% E) C% L( Y
10×酶切buffer 2.0 μl  M$ z; d* t8 h& ]9 e# Q
限制性内切酶 1-2 u（单位）
; z9 h# ~" g, n2 N" [0 ?加ddH2O 至 20 μl5 g. _9 L: J" a/ A
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。+ Y# O9 V, U) K+ [5 O5 T5 y
3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。
+ n5 a) w( V# ~' y* i4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。2 ]# V/ U7 V% z3 e* A+ h
5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
4 F; \5 p7 D& e8 X0 b8 }1 e* C$ ^6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。1 H# x! u3 G- ]2 x$ U$ c2 S3 d
7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。. p3 j1 f. O! O" L- q+ g
二、电泳检测
: X1 `. r! z0 f- G. V; v取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。 / W7 [2 `/ I+ n) A1 d
三、注意事项
4 Z& K9 o. Z5 m9 O% s1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。0 w3 e. N& A+ a3 `, L( I+ S
2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
& G  o, i4 R& j+ D1 a% g3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。2 J" ~, q/ O$ l9 F- o: s! Q; N- }
4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。# Q) u) u2 \4 x3 Q. _$ z; ?# \
5.注意星号酶切活力。: C4 J# E( U+ `2 F  ?9 J: x5 g0 M

mhqh

楼上各位，我要大量DNA。那我这么说吧，把问题改成这样：
( |4 K# J7 j/ b$ n. F1 O- D8 j! s" F- W( e8 i# f3 x
我要一次性切200μgDNA，总体积是多少mL比较合适？
% M- \" H$ I1 r% Q: v
; `9 I5 s* S) C0 J1 q（切了之后，我用苯酚氯仿抽提，用异丙醇70%乙醇洗涤，去掉酶和buffer）

mhqh

. m- X5 S7 o  ?& n! R& L( F0 {
$ l) C' Q" t' Q: S/ t楼上各位，我要大量DNA。那我这么说吧，把问题改成这样：
6 I, o5 c% `, f- F3 i  z! Z2 m
5 s( q8 d6 G- l4 R. x4 G" x; G4 @# o我要一次性切 0.5～2.5 mg（毫克）DNA，总体积是多少mL比较合适？0 X, F+ j# d8 t0 M* _+ }5 [

& O  ]6 K; k) F+ Q（切了之后，我用苯酚氯仿抽提，用异丙醇70%乙醇洗涤，去掉酶和buffer）

mhqh

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( j: i1 E% `' V7 V5 M6 t
) ^* B, y. s$ O: c6 b非常感谢你！ 但是我想要一次切200～2500μg（就是0.2～2.5mg）。所以问问切的浓度

mhqh

回复 86964109 的帖子- ~- P% O% @* s0 m3 m
* q( y2 R+ e5 i0 N# ^& Z
我要一次切0.5~2.5mg（毫克）