Realtime结果异常是SYBR不好么？

wuzhoulingxiao

这几次做的Realtime PCR实验，一开始用的是TAKARA公司的SYBR并以GADPH的引物实验，结果有Ct值是4或6的情况。但用了Bio-rad公司的试剂再重复就正常。如果用的是Actin B引物那不管用哪个公司的SYBR都有Ct值异常现象。请问大神是啥原因？

86964109

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3 B9 l7 e' u  [你的异常是指Ct过早吗？是不是引物的问题呀，多做几套引物的比较一下呢？或者把模板稀释下

wuzhoulingxiao

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模板正常，因为每个样都做了2个重复，一个正常，一个异常。

86964109

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- i% ^! ]7 V9 S1 v回复 wuzhoulingxiao 的帖子
* v3 R# U2 e3 `# f- G) b% [* l8 R
4 @% _. ], A. u3 L/ ^1 s* |你的模板是怎么加的？1μl的加还是稀释5倍后再加5μl？PCR重复性不好有可能是模板体积小，分布不均匀所致，不知道你的是不是这个原因。还有你的SYBR试剂都多久了，如果是新的应该没有太大问题才对，除非被污染了；另外仪器有校正过么？- H) G7 b$ L! q  Y0 i

wuzhoulingxiao

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+ U/ |3 d6 S1 [$ F9 B5 b5 v7 p  t. G) S' G; C' [8 w9 K) g
我的模板是按经验稀释20倍的，加1ul。SYBR是新到的TAKARA的，而且新开封，没有污染。

86964109

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  O+ Y! g- G+ x* ^+ I5 d0 N: }/ ]我不知道这种操作对你们来说是否是已经成熟的，不过仅就我的经历来说，即使我们拿2μg质量很好RNA逆转录出来的模板，直接稀释20倍取1μl去做PCR，结果也多是很不稳定的，模板中小分子团混的是否均匀，移液器的误差等等...

sdyinong

可以尝试不稀释试一试，也需要确认是不是仪器的问题，有的孔可能有问题

lhmxm

个人觉得罗氏的染料比较好