脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
8 D$ d# a: F! B! c. P剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。) m$ p' c- n+ [. {) S7 @
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；0 r* X. C5 ^( b' Z$ o7 D% P$ F6 F# ~
5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。
9 z; B+ R) }  W! b6 H* T以上是我的组织块贴壁法，请教：
$ W6 v2 n5 U9 y8 ~①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？
2 a$ E) N+ E* Z, I. J; G# c4 m②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
6 J# n, D( I$ q7 Q③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。
: v. O8 R8 Z; ~5 E0 x  y剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
" L% m2 m( ]! e% l9 |) l1 _用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
' H2 ]1 |/ x3 `# K. n' \: W$ k以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

+ I. {- m* g& ^2 z/ i* Y/ T7 I
6 k  o2 b+ C9 }& E9 {回复 老姜 的帖子
7 u( d& t% P: u1 [; l2 ]$ k! c' F2 y: `8 x; z

' j. k  g; J9 m* M% V1 s这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
* ]- ]# I; ?3 F1 F需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。2 Y/ G2 P& a& ^& G
离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。4 H7 I; O$ H0 e$ W( \3 J! t
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 ( \& r; D2 m  ~" @  [$ A4 t8 T
回复 老姜 的帖子

& S9 s/ `  I6 D" v0 k
你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
# s( ~7 r3 e4 u先剪成条儿，再剪成小块儿
' c' B5 @( h2 ~/ G; n  r, x要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起
* M& R, |, q$ J5 |直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

回复 湖南干细胞 的帖子2 l" O3 E# e: D0 I( x
8 N! _6 u0 ?" f: T" q* v* X; `
1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。, R: D, e& W3 f% j
2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。: o# t" L& n7 v0 K% z
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）
  \# W) q, d0 S; ]4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。+ a; ~, l* a* |4 @/ o
供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子4 b) K) y+ M' }) M5 F

+ M0 Z2 E- i" F需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

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1 P& _' E4 q* K6 d
回复 dongxin 的帖子
5 A, H& I7 ]) a" g
! j" w# N+ w) y  F2 F谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！