脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

" B* \9 h! }& `9 ?- S" a' i

* l! ]7 {. ~6 R1 u将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。  a) j* @0 u. h; M
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。1 w& z! J" Q! S! X/ X  T0 O
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
) l  N6 Q# w& n: v5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。
8 I' i6 H6 ~3 ^, I8 b: E以上是我的组织块贴壁法，请教：
) h$ \- l, p) ~①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？
- P# W# j- b# G, l+ J②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
6 v) c0 ~/ ~. r, y4 F# K6 V4 N. I, o③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。
/ i$ L) _" ^2 Y& ^5 @剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
: g5 ^9 I# V/ {; a. w0 ^/ D, T用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
  C) V4 p8 ?) I1 P以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

  J* \8 x5 }- i; h' M6 f) d2 ]9 P
" N7 S* r3 ]- E6 l3 ^9 N* X
回复 老姜 的帖子
6 w  ?2 m: ?, `' w' g6 Q6 c2 a& F, d6 M! J- R- i# S  K
4 q; [3 D2 n- [+ [  J+ L
这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
9 F: {" V& R3 t! g5 i需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。0 a/ R6 P, X, k
离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。8 _& A( n4 `" }. A* m+ d
9 k% D( J9 |8 o7 K! e

ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 : n, p! L5 y0 p' V: W
回复 老姜 的帖子

: x1 q. y1 Z7 Z% V! x- Q, W' @你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
) U! D$ t) d' N+ H' ^3 G  o4 Z9 {5 A先剪成条儿，再剪成小块儿( u* F& `* Y0 p( B2 [
要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起# [2 V# ?4 H8 I9 e& M1 N/ J0 t
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

回复 湖南干细胞 的帖子1 S5 L7 J. W3 }' y" v

2 l6 R  |1 `  [& V7 [1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。$ N! j& o  j% ~/ z; N- N
2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。
' s, H! i1 l8 C0 }, V+ a1 z3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）
) f# `- n/ _1 z. }4 o+ G4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
' g" Z) d3 S% A8 g0 N4 W供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子
. N  ]5 }+ @1 k4 p& ^. e2 H
& |; o7 D$ D1 B7 m" l  o0 Y需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

$ Z" a/ P6 z" }  L/ m- o8 f8 B$ k! A) r- g8 ~
回复 dongxin 的帖子8 [3 V7 B8 T5 Y7 d3 i8 Q  F

9 ]+ E; ^5 l( `5 p" X. _. @9 o4 `谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！