脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

( [8 N: t. Q6 L: @0 n" V/ S
' U, t( _: `9 `  b. w将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
( F/ ~0 q4 `& W1 L6 w, A/ |剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。
9 [& X1 ~5 r6 Z: ~4 d' B4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
# R3 n" O) x1 u5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。/ x, q! x+ D8 a4 G
以上是我的组织块贴壁法，请教：
3 I: ?9 \2 ^$ N6 |7 {* R/ g; I①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？
8 }6 B4 h# M/ q/ X- P6 v②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
& u* S" t: R/ J- R③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。
% g: ]' F# C+ e/ [+ X* v剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
; X$ x6 j* x) n% x% K+ ^用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
# o. ]; @& D9 B4 n# s- p以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

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, A/ b7 Y" d, b7 }3 j4 K9 n/ w5 b& O# u) _

2 Q. b8 R, T) T2 A) h这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。) E: u. Y  i, X
需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。4 l0 Q4 m' b  I/ w
离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。/ A4 a, e8 O/ D1 Z6 q  U) Z

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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43
4 R% C$ K) H/ q* |3 a1 |2 X5 g回复 老姜 的帖子

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你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿2 s+ Q9 Z0 ~; A4 F1 }+ ]3 w$ I
先剪成条儿，再剪成小块儿
/ E) |1 u2 k/ x要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起
& r# [! h$ V0 `3 T+ g直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

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" S# M2 n% A( i$ |1 s% l9 W3 @: M4 S0 G9 u: r! M- Y/ g4 D) l
1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。
9 w# }' g, q8 p6 r  v2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。) k! L, v4 U+ K" U- W1 `
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）& _* `  `7 j7 P: |- W, |
4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
4 [7 G6 ~. R* M; Q% J% b( r  B供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子% W- j4 {: o" O

) n* i  F8 E! C/ x+ e% x- V需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

( }8 P* e/ ~* z  u- K0 Q
( \4 L: r. M0 ?; |2 w
回复 dongxin 的帖子) Z; M/ s  m1 Z
  P+ M* W4 ]' h- X/ J- t) P
谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！