请教大家一个有关阻断信号通路的问题

ind6562

各位高人，我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路，有人能告诉我具体的步骤吗？
9 j0 f/ B# s" z. }我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物，然后将转染复合物加入到培养基中（请问大家这里是不是要用特殊的培养基，还有要不要加血清？），再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗，中间会不会还有其他步骤？还有一个极其重要的问题：这些过程是如何做到无菌操作的？
7 i* \7 p3 D: c$ C; f" z2 ~* }如果有做过类似实验的人，能告诉我一下具体的步骤吗？感激不尽！

461650833

可以构建shRNA干扰载体 直接转染啊

ind6562

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1 P- @, L3 d0 U2 j3 g不好意思，可以讲详细些吗？

monk125

这是求步骤的吗？ 看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧？
3 r  {# k! x1 G7 c% a你买lipo2000的时候会送你操作步骤的，这个你放心好了，上面很具体, y% A7 c' W% g% ~- K6 x& m
还有就是培养基的问题 转染所用的培养基是无血清的培养基 跟你你养该株细胞的培养基一样的 不过是无血清的 但是 实际上只是混合液是无血清的 你的细胞还是预留一部分完全培液的
$ ^, u- O* T5 @, ~$ ~# Z  Z一般的步骤是# `3 ~9 F7 Q. U$ c
1 转染前换新培液
9 i2 O& `. H6 Y1 \2 e8 j6 B1 C2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min) i- i6 [0 I5 z/ x5 Q
3 上述两种混合液一起混合 并静置20min- R+ M" _- H' c7 y5 s
4 转染细胞4-6h后换新培液" n  ^  X( A# H

& h. Z# r6 W5 i% K& R0 D  {注意：做好control 对照试验 培液要先预热 细胞不要长太满，切提前一天铺板

ind6562

回复 monk125 的帖子' z4 J% A0 |/ k: F* G5 w. C

6 D5 J" @6 {9 A( F太感谢了！！

ind6562

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) B" }4 G4 L' s* Q高人，不好意思，我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验（貌似是用荧光什么的来检测），但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西（其实lipo2000说明书我已经看过，但里面很多内容我还不理解，惭愧~），是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢，能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗？

monk125

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  F+ ?. _/ A( H) W: H9 \
* q3 I: g4 @% v8 @% _( E5 W; |  NsiRNA 就没办法做转染效率检测了，像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的，比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记，你可以做几组不同的浓度梯度，然后流式或荧光显微镜 看你的GFP positive那群细胞的比例，在某范围内应该成线性的，你就知道大致效率了。

monk125

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, ]& j" ?- K) g! F$ s& p5 T  y( ?, G2 ^
siRNA 的效率怎么测 我也不懂 只能你设好梯度后 收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了，做个realtime 就知道了

86964109

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) `' E% T+ `' z' _$ L. W
' }6 s4 z+ d% i1 O! l7 ysiRNA也可以加荧光标记的，另外，一般会设置一个荧光标记的阴性对照，侧面反映转染效率，siRNA干扰需要好多对照，详情参考这个帖子吧http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795