请教大家一个有关阻断信号通路的问题

ind6562

各位高人，我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路，有人能告诉我具体的步骤吗？) E3 p1 D6 a4 C
我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物，然后将转染复合物加入到培养基中（请问大家这里是不是要用特殊的培养基，还有要不要加血清？），再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗，中间会不会还有其他步骤？还有一个极其重要的问题：这些过程是如何做到无菌操作的？
2 T+ M) f* Q( M. K3 G6 `! a3 `如果有做过类似实验的人，能告诉我一下具体的步骤吗？感激不尽！

461650833

可以构建shRNA干扰载体 直接转染啊

ind6562

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2 z$ U4 k( X' R5 p9 s0 Q8 {; _4 O4 P& O7 l$ }  P. ]2 R, P0 t6 z
不好意思，可以讲详细些吗？

monk125

这是求步骤的吗？ 看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧？
' q9 e+ w1 n4 q6 k8 q$ X; K" J你买lipo2000的时候会送你操作步骤的，这个你放心好了，上面很具体
3 i, V1 _- r1 L) D" _还有就是培养基的问题 转染所用的培养基是无血清的培养基 跟你你养该株细胞的培养基一样的 不过是无血清的 但是 实际上只是混合液是无血清的 你的细胞还是预留一部分完全培液的 " Y* E/ J& b( T4 c; y( ~
一般的步骤是
. H- k! R9 K" p; J% ?  t" E+ |  d* e1 转染前换新培液) J& V; o. Q8 n" W7 g
2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min5 Y+ T  R. E% x: _& q2 j
3 上述两种混合液一起混合 并静置20min
% |. b  ]4 v- t( J0 t4 转染细胞4-6h后换新培液& Z, Z, \7 j# m2 m8 P

& P% [! t% I$ i* N7 W2 p2 c9 b( M7 X注意：做好control 对照试验 培液要先预热 细胞不要长太满，切提前一天铺板

ind6562

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1 M' O: |. ^; U( _. ~* Z) D/ ~5 u4 C
太感谢了！！

ind6562

回复 monk125 的帖子! m9 c  f' l& C5 @$ c
4 i, h; g) W+ @0 g$ Q6 i# J5 H" ]
高人，不好意思，我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验（貌似是用荧光什么的来检测），但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西（其实lipo2000说明书我已经看过，但里面很多内容我还不理解，惭愧~），是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢，能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗？

monk125

回复 ind6562 的帖子( B" R6 @! f4 e0 S1 k4 J
' p, {% K& M6 G8 E' o8 ~
siRNA 就没办法做转染效率检测了，像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的，比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记，你可以做几组不同的浓度梯度，然后流式或荧光显微镜 看你的GFP positive那群细胞的比例，在某范围内应该成线性的，你就知道大致效率了。

monk125

回复 ind6562 的帖子& O$ c& {6 ?. _4 ^: Q9 v
) B' b6 r( u9 |) p
siRNA 的效率怎么测 我也不懂 只能你设好梯度后 收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了，做个realtime 就知道了

86964109

回复 ind6562 的帖子* z7 l! c3 k+ ?6 W) M7 n

& o7 B1 [/ z/ J: Z1 BsiRNA也可以加荧光标记的，另外，一般会设置一个荧光标记的阴性对照，侧面反映转染效率，siRNA干扰需要好多对照，详情参考这个帖子吧http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795