请教大家一个有关阻断信号通路的问题

ind6562

各位高人，我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路，有人能告诉我具体的步骤吗？$ ~" e0 `. p) x0 ?1 x
我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物，然后将转染复合物加入到培养基中（请问大家这里是不是要用特殊的培养基，还有要不要加血清？），再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗，中间会不会还有其他步骤？还有一个极其重要的问题：这些过程是如何做到无菌操作的？
$ X. I; G( p4 c! v( N( t% q如果有做过类似实验的人，能告诉我一下具体的步骤吗？感激不尽！

461650833

可以构建shRNA干扰载体 直接转染啊

ind6562

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# F3 Y  W8 G9 Y" r; h
  i/ C; \* K6 f2 s不好意思，可以讲详细些吗？

monk125

这是求步骤的吗？ 看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧？' T; D/ y# |' G4 b9 s( `
你买lipo2000的时候会送你操作步骤的，这个你放心好了，上面很具体
8 x/ L+ p# w7 e6 P, {还有就是培养基的问题 转染所用的培养基是无血清的培养基 跟你你养该株细胞的培养基一样的 不过是无血清的 但是 实际上只是混合液是无血清的 你的细胞还是预留一部分完全培液的 . y; ]3 O$ x2 c% K; K8 f
一般的步骤是* }$ F( i# F0 N
1 转染前换新培液% `8 l9 h% f3 K9 M5 r* x
2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min, ?1 q7 b! a5 n' k9 D1 T
3 上述两种混合液一起混合 并静置20min
$ K, J$ L+ R( {' x- }4 转染细胞4-6h后换新培液8 E4 S$ ]( k. D7 _

  m1 i# f3 ], r1 ]" \# n注意：做好control 对照试验 培液要先预热 细胞不要长太满，切提前一天铺板

ind6562

回复 monk125 的帖子$ u* U* @1 O2 I8 H% i6 G: ^

4 T: v7 _% Z( m) _6 U$ o% t0 y太感谢了！！

ind6562

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: r9 u' I- z8 S  ]
% x$ E# u- f8 h/ m5 X0 ~- q高人，不好意思，我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验（貌似是用荧光什么的来检测），但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西（其实lipo2000说明书我已经看过，但里面很多内容我还不理解，惭愧~），是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢，能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗？

monk125

回复 ind6562 的帖子/ b9 n% V( p4 l7 i3 z  A9 A% F
0 T6 w- w; E  j; B! K- \
siRNA 就没办法做转染效率检测了，像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的，比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记，你可以做几组不同的浓度梯度，然后流式或荧光显微镜 看你的GFP positive那群细胞的比例，在某范围内应该成线性的，你就知道大致效率了。

monk125

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  N3 O; J- e8 \& m- W; |, H! d- h4 C3 ~1 f$ [0 v- o8 t
siRNA 的效率怎么测 我也不懂 只能你设好梯度后 收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了，做个realtime 就知道了

86964109

回复 ind6562 的帖子, L0 A' h# i$ ]: y% z# S
) T3 Z: U) C5 P" G1 X0 _
siRNA也可以加荧光标记的，另外，一般会设置一个荧光标记的阴性对照，侧面反映转染效率，siRNA干扰需要好多对照，详情参考这个帖子吧http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795