脐血间充质干细胞培养方案，求解………………

笨球球开心

求解…………我近期做脐带间充质干细胞实验，很不成功，方法如下：1）提取脐带至培养皿中、冲洗2-3次；2）分离脐动静脉、外膜；3）在培养皿剪碎，离心管消化2、4、8、12h（12h成功一次）；4）过细胞塞，加PBS，离心1200r/min，5min；洗2次，pBS 1000r/min，5min；5）培养，有白色沉淀、混匀，培养。后来不贴壁，死亡了，求解步骤的不足、注意点……消化在离心管还是在培养皿（玻璃），有影响？消化时间、消化时血清：胶原酶2比例？转速、时间怎样？求……

湖南干细胞

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5 J. z% P9 N/ t
$ C2 m1 [* @9 t2 w& I* p请问，您用的是什么酶消化，一般消化多久？消化到组织块基本没了是不是过度了？

pailishi

消化酶调整一下

湖南干细胞

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0 N; w4 u" k$ i' B
% d" h# l% U$ j! s2 u  N7 c0 S我也做了几次脐带的酶消化法，原代培养成功过1次，后来就没成功过了。$ L6 C; N  ^4 n: M6 Z, g3 y
步骤如下：
- }9 |3 t- [) A2 u1）脐带在半小时内开始操作，PBS冲洗3次后，剥离动静脉，撕出白色胶块（时间1-2小时）；
7 k' d+ G, ]* t0 F! }2）剪碎（0.5-1小时）成0.5-3mm小块，转移至离心管中,组织块：10%FBS:0.01%Ⅱ型胶原酶=1:1:1或1:1:2，消化6-12小时不等，直到组织块基本消失，剩下膜状。
  V* m9 s) h" z. x3 U. O6 Y3）用细胞筛制造真空抽滤后，PBS 2000RMP,10min；1000rmp，5min各1次，细胞沉淀较多。
. w6 y+ V6 {! O4）镜下可见细胞及细胞碎片，碧云天的PLL包被15s后10%FBS-D/F12培养，细胞就是不贴壁，或者贴壁后没几天就飘了？真的很急。( k7 |  {, R! c) B9 @: X
请教你们的培养基都是什么，PH值多少？我的PH值在7.2-7.4之间，用l几天后PH值就是7.5。5 |  a: _: ], c

笨球球开心

& [% s' a$ [8 i2 K" Y4 E' A

$ Q: B4 {! i* z1 T3 w/ j改正：是脐带间充质干细胞；“2）分离脐动静脉、外膜”改为“2）分离脐动静脉、外膜，提华氏胶”；“消化时血清：胶原酶2比例”改为“dF12+10%血清：2型胶原酶比例”