脐血间充质干细胞培养方案，求解………………

笨球球开心

求解…………我近期做脐带间充质干细胞实验，很不成功，方法如下：1）提取脐带至培养皿中、冲洗2-3次；2）分离脐动静脉、外膜；3）在培养皿剪碎，离心管消化2、4、8、12h（12h成功一次）；4）过细胞塞，加PBS，离心1200r/min，5min；洗2次，pBS 1000r/min，5min；5）培养，有白色沉淀、混匀，培养。后来不贴壁，死亡了，求解步骤的不足、注意点……消化在离心管还是在培养皿（玻璃），有影响？消化时间、消化时血清：胶原酶2比例？转速、时间怎样？求……

笨球球开心

" S; B+ s1 S# x, G

- \1 z+ b7 O) \  {9 Z改正：是脐带间充质干细胞；“2）分离脐动静脉、外膜”改为“2）分离脐动静脉、外膜，提华氏胶”；“消化时血清：胶原酶2比例”改为“dF12+10%血清：2型胶原酶比例”

湖南干细胞

回复 笨球球开心 的帖子
0 L# ]0 Z6 |9 y0 Y0 H! N" W9 F$ \  M4 G
我也做了几次脐带的酶消化法，原代培养成功过1次，后来就没成功过了。8 c( i$ f5 |' C; L0 X
步骤如下：
" Q5 B8 [# w# o$ s  G4 n* }' P1）脐带在半小时内开始操作，PBS冲洗3次后，剥离动静脉，撕出白色胶块（时间1-2小时）；1 `0 [& T/ W/ s, s& m# ~$ p
2）剪碎（0.5-1小时）成0.5-3mm小块，转移至离心管中,组织块：10%FBS:0.01%Ⅱ型胶原酶=1:1:1或1:1:2，消化6-12小时不等，直到组织块基本消失，剩下膜状。$ P3 N; z% S3 h& {
3）用细胞筛制造真空抽滤后，PBS 2000RMP,10min；1000rmp，5min各1次，细胞沉淀较多。" ^( ?+ k: q1 m6 z9 a" M4 v
4）镜下可见细胞及细胞碎片，碧云天的PLL包被15s后10%FBS-D/F12培养，细胞就是不贴壁，或者贴壁后没几天就飘了？真的很急。4 v( @/ d9 q1 y6 ?: g! r9 b- a- f
请教你们的培养基都是什么，PH值多少？我的PH值在7.2-7.4之间，用l几天后PH值就是7.5。
+ f! ^7 h" |. j: V% b9 Y4 y

pailishi

消化酶调整一下

湖南干细胞

回复 pailishi 的帖子
9 X$ P" X& h7 i1 J
0 H7 n4 K0 b5 C2 h请问，您用的是什么酶消化，一般消化多久？消化到组织块基本没了是不是过度了？