特定启动子+GFP构建报告基因

刘森泉

想把特定的启动子与GFP连接进去病毒表达载体构成报告基因，病毒转染细胞后，观察细胞分化过程中的基因表达窗。想请教下一般用什么质粒载体？如果要筛选稳定细胞株是不是还需要加上筛选基因，还是GFP就够了？启动子一般是UCSC中查找-2000bp至+100bp吗？提取DNA对特定启动子PCR容易吗？谢谢！

细胞海洋

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zhongguorenwan

急切盼回复！！！我将几个不同启动子替代CMV启动子后能用流式检测GFP表达量来确定这些启动子的启动效率吗？
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zhongguorenwan

想问下楼主的问题解决了吗？如果我想比较几个启动子启动基因的表达量可以用GFP吗？
4 W4 k* f* n7 J8 Y' p9 U

pingzongyunlan

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: d, X; w+ d1 V9 ]- M
: w/ s! e/ K! M9 U( O一般用于瞬转，但是你想整合的话可以用慢病毒载体，这个可以进行基因组整合，pCDH系列载体还可以，可以查阅一下~ESC细胞转染确实是个问题，脂质体转染方法较多，所以普通载体确实较难整合，但是也不排除确实有整合的细胞，利用筛选标记进行筛选，还是可以得到稳定整合的细胞的，不过G418筛选时间较长，ESC细胞可能会扛不住，若可以选择用puro进行筛选，效果应该会好一些~仅仅是建议~

daviddow

FUGW

cheetah2020

病毒转导不太了解，请知道的童鞋给普及一下。
$ v$ k' A$ P- Q2 B以前做过质粒转肿瘤细胞的稳定转染系，pEGFP-C1上带有G418抗性基因，转染后用G418进行筛选，可以得到很好的效果，但筛选过程是个技术活，有兴趣可以和我深入交流。
+ T$ ^# I& L3 gMSC是否适用于这种转染方式不确定，毕竟干细胞的传代能力不如肿瘤细胞。

goodboy

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# N5 f6 b+ g( T5 C7 g' q
用慢病毒载体构建质粒然后包装病毒感染6 X- t, ?' T! G& M( G: i5 e" D0 t: V

刘森泉

回复 pingzongyunlan 的帖子. P) K7 E) S: o: R" e
6 L% o# ^- u- r; X  G: b, T6 {
谢谢，但是pEGFP-C1这一系列的质粒只能用于瞬转吧，转染human ESC很困难吧？

芦苇浅

我以前构建过启动子的报告载体，一般来说查找-2000bp至+100bp的基因序列已经足够；当时我使用Touch Down的方法进行PCR，还是很容易扩增的，只要你的引物和模板没问题；你可以考虑一下pEGFP-1载体，这是增强型的GFP，表达效果还是不错的，上面有Kan和Neo的抗性基因，这是载体图谱。