急求:关于流式细胞仪对细胞表面抗原鉴定的问题

李兰兰

请教大家一下，我的染色步奏有没有问题？& o0 P+ E- }) [5 l1 W( N
1、第一代大鼠骨髓间充质干细胞80%融合时，胰酶消化，含10%血清培养液进行终止，1000转，6min离心一次，然后加入ph7.4的PBS洗涤一次，加入0.5ml的PBS重悬细胞。. l! D! N5 E2 ?9 @6 a* t
2、加1微升的一抗CD34、CD45、CD90、CD105，冰上放置30min。
2 K' O: o2 [- X& v5 [3、加PBS洗涤2次，以0.5mlPBS重悬细胞，加入相应二抗1微升，湿冰避光放置30min。& U& D" e7 E. o. ?& ?( \
4、加PBS洗涤3次，以0.5mlPBS重悬细胞，上机。5 x1 D" A6 \* X. O( `/ }+ T  P$ o1 R
! Q* `( i$ a) Y  z
结果四种抗体及阴性对照的图基本上一样，结合率非常低，0.7%左右。
" V- i4 R+ {. d请问各位应该是什么步奏有问题，应怎样改进。急求各位指点

李兰兰

一抗CD45、CD90是abcam公司的，CD34是santa cruz 公司，CD105是millipore公司的，二抗是FITC及PE标记的，是北京奥博森生物技术有限公司的
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xiaoyurly

不知道抗体的特异性怎么样，是专门抗大鼠的吗？流式抗体一般要求比较专一/ q. M) E' b% w" L+ U
最好分开染，染色时细胞计个数，一般抗体1ul大概能染10^6左右，流式检测有2-5×10^5就挺多了，另染色时控制体积在50ul左右，别太大，孵育过程中隔段时间轻弹管壁混一下

湖南干细胞

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& ^8 |: N7 p2 H- M. ]$ G$ o6 r2 T: W0 _6 ?, K  j
我的细胞养了几代了都没有做鉴定，怕细胞不纯，做出的结果不好。你的第几代？' v% f! j: H# Z4 i/ I& K* T! W

飞翔的十字架

abcom的抗体应该没有问题，santa的看运气，加抗体后孵育最好放摇床上，有利于抗体结合
+ [' F: }1 W6 c. {9 b3 D1 k7 X  x4 Q0 Z- Y
还有，第一代不需要做鉴定，一般不会拿P1做实验的，我P2，P3都很纯，没区别

叮铃叮铃

学习

李兰兰

回复 飞翔的十字架 的帖子6 ^, A: s/ N" s% y
  K: C+ w# N- Z( @( g9 {
你们孵育是室温么？  一抗i和二抗一般加多少量

飞翔的十字架

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! r7 t6 c# U3 @# F
, Q& w0 x) W2 j# C4度孵育，二抗一般一微升足够，一抗看说明书

sjlzw

第一代不纯，一般选3-5代吧

以诚相待

你是四个一起标记的吗？抗体浓度？多标的时候浓度应该比单标高点，再有你可以单标试试怎么样？细胞得代数最好在3-5代 希望实验顺利