免疫荧光二抗用什么稀释？

请叫我晓白

我用的二抗是TRITC羊抗小鼠IgG，说明书上说用0.01M PBS加入试剂级BSA至1%作为稀释液，意思是指：将BSA稀释到1%浓度，作为二抗的稀释液吗？
2 `) v/ ]; j5 e9 _我之前只用的PBS稀释二抗，效果不好，不知道是不是与这个有关

请叫我晓白

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/ U* v% T8 H0 s5 G0 L- `7 [  e* N! {4 P2 M2 x; b; N
(l)连续冰冻切片标本，丙酮固定10min，用PBS3min 3次。
% ?3 n5 P( b. S( x(2)3%过氧化氢孵育10分钟，PBs冲洗三次。
! Q) \) W0 V, U8 Q7 m: I# E(3)正常羊血清封闭液室温孵育20分钟，倾去，勿洗。% S/ f! Q& B- {0 }* m& ]1 N2 q2 [' q
(4)加入50ul一抗（1:100,1:200）。37度 2h7 e, |- W" I* i' B& A
(5)滴加50ul二抗 室温 30min，DAPI复染5min* q' h8 P) k& W! m. K# a9 v
(6)封片:封片剂封片5 D; x- [' B8 T5 W
这是我的大概步骤请指导一下哈。非特异性染色比较多

请叫我晓白

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2 K7 n( x' W# N- G# @7 z. G/ k, P' {9 u
多谢这位老师指点。H2O2处理消除内源性过氧化物酶是一篇研究生论文上做心脏组织免疫荧光用的方法，我学习他的方法做的。. N4 S; m7 I5 Y2 \" |
一抗是大鼠抗大鼠c-kit，说明书没有建议稀释比例，因此我用了1:100 1:200 两个浓度。一抗产品的浓度是0.5mg/ml 规格100ug。这点还请您指点关于一抗的比例问题。
) p4 A: A7 l4 m抗原是位于膜上因此没有破膜: p' L9 ]. ~/ J1 ?
血清封闭37度半小时是否要比室温效果好呢

请叫我晓白

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1 E8 }6 ?: |. @
$ f# _4 g4 I( V( p我的一抗规格是100ug/200ul（浓度是0.5mg/ml），也就是1ul含0.5ug，按您说的2-5ug/ml，我刚去算了一下1：100稀释正好是5ug/ml，1：250稀释是2ug/ml，也就是说的一抗可以试一下1:100-250之间浓度梯度对吗？

请叫我晓白

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% s- N1 J/ H3 X. g( ~% ?0 d$ Y$ L. F/ U$ w% ^
一抗规格是100ug/200ul的请问一般用什么浓度呢

请叫我晓白

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2 R) o! u9 i" a. h7 y2 I+ u& m8 k; J6 R( f! f
多谢老师耐心解答# |4 K! Q: L# d3 ~! O3 @2 F" }% b! p
能copy一份您做石蜡切片免疫荧光的步骤给我吗
! @! K& J3 k2 Q% O刚接触实验很多都不懂1 B: N& ?7 n  ~5 B! x: ]& I" H
多谢了

请叫我晓白

回复 xiaoyurly 的帖子! P, V3 e4 r7 E$ m. h2 \
! H% i% H+ p2 T: a0 ^8 \
多谢多谢

请叫我晓白

xiaoyurly 发表于 2013-3-18 09:50
2 I2 F- b2 ?1 S" B# N回复 请叫我晓白 的帖子% [7 E2 }! g  T7 R1 X
7 [; d; l% F0 r, s8 g9 {
c-kit染色确实不必破膜的，我们以前也做过大鼠冰冻切片但是效果不尽如人意，后来用 ...

0 C5 h2 f4 H* c. l+ i# F7 n老师，我最近做了几次都没有结果您图片上的结果。哎 郁闷。我想请问您当初做冰冻也没做出来会不会是因为c-kit这个抗原不适合做冰冻切片？需要做石蜡切片才行？我想可能有几个原因：1.c-kit+细胞很少没有切到或找到2.一二抗浓度不合适3c-kit这个抗原不适合做冰冻切片4 g- \* ]# h# d1 ?
就您的了解c-kit是否可以做冰冻切片呢？我看了许多国外文献他们的染c-kit的方法都是免疫组化用石蜡切片（具体方法太简略了），但是结果的图却是共聚焦的图。期待您的解答。还有您做的是骨髓的c-kit细胞吗？我做心脏固有的c-kit细胞

请叫我晓白

xiaoyurly 发表于 2013-4-17 15:45 - D4 b5 K5 v5 T* ?
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4 H) e) g0 w7 t8 x; M5 d+ K
5 u, a. u( a( I/ c( M# C染冰冻的确实少，但是抗体说明书上明确表示可以用于冰冻切片染色，我们染不出来才 ...

9 }, z- n1 D" l& |
是的，是染梗死后固有的c-kit心肌干细胞，没有注射细胞，所以找不出来，根本达不到文献上那种效果。
3 ^1 ?! f% s6 E3 z" R真是郁闷。准备再做几次试试。有新问题的话还请您多多指教啊

请叫我晓白

回复 xiaoyurly 的帖子/ P; L% X6 v6 i$ j5 [" u7 W
( Q  z: V; K0 h, t( [

9 N7 d# o0 H8 P* C/ C! @0 f7 |

. X! O* A1 d! W* l$ {4 X: h老师，我又做了一次，请你帮我看看这张图是细胞吗