[求助] 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验，用WST-1检测OD值过低，？？？？、

Yorkshining

最近做小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验，用Con A刺激，用碧云天的WST-1试剂盒检测，但是检测的OD值过低，也没有明显的增殖，这是怎么回事啊？; G; c3 V5 X" c- a7 d/ K& U6 e

5 k* B( L8 E% o2 y7 V8 o+ ]/ [具体操作步骤如下：3 W0 A+ C5 x" m9 D

2 J% g- I+ Y9 b+ f, X2 j一 小鼠淋巴细胞的获取：
/ B* b" T4 `# H3 t5 {: f1 H8 G
' T5 o& a/ e. r9 Z$ Z1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。
! Q% r$ d6 z9 O; v
% V( V8 v6 O! @9 g2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在DPBS中洗3遍，充分湿润。
" n& |1 @  C4 w" I) T& g2 ?8 C4 f/ R" P% A0 |" G9 o& ], w
3、将200目得纱布至于35mm的皿上（不可用6cm皿），将纱布绷紧，底下盛有少量DPBS，用10ml注射器的活塞按一个方向均匀研磨研磨，边研磨边用DPBS湿润。* p) L6 |4 ]9 ?8 J& {
. Y; i. F1 ]% N  @9 D6 B
4. 将收集到的淋巴细胞悬液1500 rpm离心3min，每个脾脏加入7ml红细胞裂解液，室温作用30min。
8 N/ J* R  f2 `+ N& z* H; D2 W8 t' l1 j+ F5 k8 Z
5、1500 rpm离心3min 弃去上清，再用DPBS洗涤3遍，每次用4mlPDBS洗涤，一般在第二遍洗涤后方可见到明显的血细胞被移除，最后用1ml DPBS重悬。. o7 n3 j1 N* [- V
" j% S' K, j. j/ f
6. 用牛血清湿润试管壁，除去多余血清，取4ml的70% Percoll 加在15ml 离心管的底层
% W0 M& @5 J! u) Z
2 r8 |/ ]% O1 l+ h1 p1 r. ^8 k7.用巴斯德管吸取4ml 40% Percoll，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。) F4 c( i$ b# r2 _$ C0 D+ P% v3 K$ v

$ S/ u; x- s/ C* B8. 将洗后的细胞悬液按步骤7中的方法缓慢将其加到分离液的表面。3 j  b" e3 _9 }* m: F
5 a* J& Z  V- j" D; P
9.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温离心20min。
( a8 U; i9 ]# `9 K+ O8 [4 n/ o1 b. W" x& g) [+ Z3 `( y; f- J/ z
10.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，用DPBS洗涤3遍，4ml DPBS每次。5 T# w& W3 k' v& b9 U5 a6 w. Q

: h2 K1 ^/ ]: z# e1 p1 X二．细胞培养
. Z1 ~6 q$ P* n, ^
3 z- e( e2 p) _" p; n' w培养液：RPMI 1640,10%NCS（Gibco），双抗。
% v3 W" o+ \/ P7 Q三 Con A刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验浓度与作用时间的摸索& j, t  S; t. g& Y5 V
分别用1.25ug/ml，2.5ug/ml，5ug/ml，10ug/ml，和20ug/ml的ConA （sigma，C5275）分别刺激24h，48h 和72h，每孔10万细胞，再分别用碧云天WST-1试剂孵育4h后，检测，结果各实验组的OD值过低，基本都在0.174左右。而空白也差不多在0.17左右，都没有明显的增殖，望大家给点意见啊，不甚感激。。。
' C7 U9 E# m# K2 [7 }9 G( C; I

chutu

红细胞裂解液作用30分钟，是不是时间太长了？估计对细胞影响较大。既然后面还有密度梯度离心分离，裂红的必要性不太大。另外用CFDA-SE荧光染料染色然后流式检测的方法应该比WST法灵敏。

Yorkshining

回复 chutu 的帖子
3 n' B4 F9 M+ z4 Y1 K2 z. v# @& |! @1 y) n# ~! B& w" q
谢谢，还有一个问题就是，后来做了几次，已经出现了明显的增殖了，我用的阴性对照组（不加ConA组）的细胞，随着培养时间的延长，其OD值越来越低，导致我的刺激指数都快到20了，不知你们有没有遇到过这样的情况，谢谢？