请教关于骨髓间充质干细胞胰酶消化传代的问题

李兰兰

    请教大家一下，我培养大鼠骨髓间充质干细胞，细胞融合80%-90%时，PBS洗2遍细胞，然后后用1ml 0.25胰酶和0.02EDTA消化，大约2-3min，平拍培养瓶细胞悬浮后，吸出胰酶，用培养液10ml终止消化，然后吹打分为2瓶（原培养瓶和一个新培养瓶）。但是传代后细胞不多。我感觉是我传代过程中细胞在消化后随着弃去胰酶丢掉了，$ U6 ^3 D5 h* X! l
请问大家，- c8 R  ?1 b# Z9 J
1、你们消化后胰酶需要吸掉吗？
1 J3 C0 M: W4 r- o$ i; i2、培养液终止消化后需要收集细胞离心吗？离心的话大约多少离心力，几分钟？
$ v' |, N$ h' A8 r. p3、传代时原来的那个培养瓶还继续用吗？
8 _& N( [+ y( ?( s万分感谢大家多多赐教！
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希望之光

1 最好吸掉胰酶，你的浓度太高，最好用0.05%商品化的那种；
6 v8 P) ]* Q0 X8 C- z1 T& ~: L: e2 要离心，800转5min；! a. d4 I9 i* _& p8 m7 w; \4 i
3 可以一用，但经费很足的话，最好别用，皿底是有机质的，用过一次会有损耗。
/ c7 F' ^& {; K' F0 y希望对你有帮助

wujh1986

不一定非要吸走胰酶啊，直接中和就可以啊。实验室用0.05的浓度就可以。大概4，5分钟7 R1 a% P$ M( F6 P; u$ R! q* K9 Q
离心要根据你们实验室的离心机算出转数一般300g,5分钟左右。- j+ F5 y: `! H/ ?
可以直接用旧皿或旧瓶，但是吸附性已经不好了，如果你们实验室有条件，可以刷洗后照射完再用。

shagu

回复 wujh1986 的帖子1 o1 I2 W& F& b4 V6 Q1 m0 n
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300g换成转数是多少啊？能具体讲一下算法吗？谢谢前辈，辛苦辛苦了！

湖南干细胞

回复 李兰兰 的帖子
4 n& F; B$ W& N. u
; W- ?8 o$ ?# u吸掉胰酶的话悬浮的细胞肯定都吸掉了，原来那个培养瓶还可以继续用的，你的细胞多少天再次传代？做了流式鉴定没？

CatchField

消化后是不能吸掉胰酶的，因为这时候大部分细胞已经消下来了。消化完直接加含血清的培养基终止消化就行，然后离心分离，800转五分钟应该差不多。原来那个方瓶最好不用，如果实在要用也行，不过最好不要用三次以上了。另外原来的方瓶可能因为之前有细胞没完全消化下来，接着养会造成细胞分布不均，局部密度过高影响细胞形态。

wujh1986

回复 shagu 的帖子
* Z  p" h& E1 k  P! ~! {$ Y" N, y9 I5 j/ b( H" e
你要看你们实验室的离心机的半径，然后换算一下，我们原来实验室换算完是1300转，我们实验室的人经常用1200转5分钟

zhouding3000

胰酶消化直接用培养基终止，然后离心即可，1000rpm 5min，之后传代。
, Z6 V" Z5 `) A9 V" ?- ]原来的培养瓶用PBS洗两次后可继续使用的。

李兰兰

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( x/ f; E4 c3 T! z+ i6 K  u# ?, N5 F. ^. V# A$ k
感谢你的赐教哦

李兰兰

回复 wujh1986 的帖子0 @$ [5 y% ?+ p: q: `* @3 R

# G( |+ n- v- g" J直接紫外线照射就可以么？多长时间呢？6 j" ~1 U, f% h/ N: m