请教关于骨髓间充质干细胞胰酶消化传代的问题

李兰兰

    请教大家一下，我培养大鼠骨髓间充质干细胞，细胞融合80%-90%时，PBS洗2遍细胞，然后后用1ml 0.25胰酶和0.02EDTA消化，大约2-3min，平拍培养瓶细胞悬浮后，吸出胰酶，用培养液10ml终止消化，然后吹打分为2瓶（原培养瓶和一个新培养瓶）。但是传代后细胞不多。我感觉是我传代过程中细胞在消化后随着弃去胰酶丢掉了，+ p1 _# Y5 f/ N. m2 i* d- o3 h
请问大家，
1 Y8 S& u; F6 [( p" p$ H1 Z1、你们消化后胰酶需要吸掉吗？% }! U3 F% i$ u& @
2、培养液终止消化后需要收集细胞离心吗？离心的话大约多少离心力，几分钟？
3 R' z- h( {& l, n9 {0 W  p, z3、传代时原来的那个培养瓶还继续用吗？3 P2 T) q2 u8 j! C
万分感谢大家多多赐教！9 u: `3 S; d: R

希望之光

1 最好吸掉胰酶，你的浓度太高，最好用0.05%商品化的那种；
9 @3 R; ]9 R8 X" Q/ I/ F5 h- w7 w2 要离心，800转5min；9 }9 E8 L. L5 T+ I% B6 ^7 h
3 可以一用，但经费很足的话，最好别用，皿底是有机质的，用过一次会有损耗。7 [( d) ^* K6 l) o2 X$ T! A
希望对你有帮助

wujh1986

不一定非要吸走胰酶啊，直接中和就可以啊。实验室用0.05的浓度就可以。大概4，5分钟8 _; H) K" m+ ]
离心要根据你们实验室的离心机算出转数一般300g,5分钟左右。
2 S6 W" a1 |$ T( z! N% F- w可以直接用旧皿或旧瓶，但是吸附性已经不好了，如果你们实验室有条件，可以刷洗后照射完再用。

shagu

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( D6 b1 O8 D. U! R
5 O, K" C) ~3 k- J300g换成转数是多少啊？能具体讲一下算法吗？谢谢前辈，辛苦辛苦了！

湖南干细胞

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- d( C, i  X1 M1 O- C
- z. N% B9 G1 W1 R) H% Q# p吸掉胰酶的话悬浮的细胞肯定都吸掉了，原来那个培养瓶还可以继续用的，你的细胞多少天再次传代？做了流式鉴定没？

CatchField

消化后是不能吸掉胰酶的，因为这时候大部分细胞已经消下来了。消化完直接加含血清的培养基终止消化就行，然后离心分离，800转五分钟应该差不多。原来那个方瓶最好不用，如果实在要用也行，不过最好不要用三次以上了。另外原来的方瓶可能因为之前有细胞没完全消化下来，接着养会造成细胞分布不均，局部密度过高影响细胞形态。

wujh1986

回复 shagu 的帖子  ~4 ]! e/ K& E2 V

7 t# B3 y% c! C. Z9 X. C6 U2 \你要看你们实验室的离心机的半径，然后换算一下，我们原来实验室换算完是1300转，我们实验室的人经常用1200转5分钟

zhouding3000

胰酶消化直接用培养基终止，然后离心即可，1000rpm 5min，之后传代。9 G" e4 p! R- C2 p' M
原来的培养瓶用PBS洗两次后可继续使用的。

李兰兰

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  l0 o5 i6 c; J: d: i
  z" ^/ L# C% @% x& y感谢你的赐教哦

李兰兰

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8 m. J: r) U8 d# ~0 |直接紫外线照射就可以么？多长时间呢？2 ]8 U2 J) u) ]% P  w