为什么5%脱脂奶封闭需要洗，而BSA、血清不需要洗呢

请叫我晓白

最近做心脏免疫荧光，一抗是生物素标记的，二抗用cy3-亲和素。发现阴性对照没加一抗（一抗也不是染心肌的）心肌全染上色了。因此考虑封闭内源性生物素，准备用鸡蛋清洗后加5%脱脂奶（含吐温20  0.1%）封闭。9 n- k6 \* P5 y( @9 ?( l
因此我想提的问题是：
) i9 }& c: w4 h9 u" d2 x! ?1.用脱脂奶封闭后是否需要PBS洗，为什么血清、BSA不需要洗？7 a2 P1 @& ?1 X# C6 j8 Z
2.脱脂奶封闭后或者封闭前是否还需要用血清或BSA封闭？
: V0 {. g# q/ H/ r. A* T5 V3.问了很多高手都没用过我的这种生物素标记的单克隆一抗，我染的抗原很稀少，请问我选择的一抗、二抗是否有错误？
6 U- X( G' W' B+ m4.如果我做加做双标染心肌，另一种一抗是兔抗大鼠a-SA，二抗是羊抗兔FITC。那么我还可以继续用5%的脱脂奶封闭，然后洗，不用山羊血清或BSA封闭吗？- j' O9 j4 L" X6 H
急盼各位高手解惑啊

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 11:21
4 s9 b, j4 s2 k. ^  d+ f哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗 ...

% c* P) n2 n+ I' Q+ `可是我的阴性对照连一抗都没加，全给染上了，而且是背景很好，这种情况是不是肯定发生了结合反应呢？如果没加一抗，那亲和素的浓度影响不大吧？

请叫我晓白

yuhaoze 发表于 2013-4-26 07:58 ) ], p3 w# n- n, W
1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯， ...

! E! l' T9 X. r- W' r我的实验不研究磷酸化，只是染心脏一种细胞膜上抗原
- l# b8 e* ]; h( A“不管是用什么封闭的，最好都要洗”啊？为什么所有免疫荧光的步骤都说BSA或血清封闭不洗啊？

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 14:34
: Q; N! P+ A9 b9 k回复 请叫我晓白 的帖子
4 U8 M  t% y+ P5 T6 w9 U8 I- j* W) E% a; Y- ~
我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都 ...

' x* {- L. B% n% A/ Z; k
多谢。我上次用的5%BSA封闭，抗体稀释液是1%BSA+0.3%triton。我这次准备用蛋清、脱脂奶封闭内源性生物素，然后用BSA封闭，试试结果。多谢你的帮助

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-27 10:42 8 u2 I6 Q+ J4 y: d) Z
回复 请叫我晓白 的帖子0 i% g# f! T& z& I) r

# [0 v9 I) d5 d2 M6 z感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。

" l7 Y$ c; n& n2 j6 w( W的确是avindin的二抗而不是streptavidin。这个是博士德公司的不会搞错。我看了很多参考文献都说可以用蛋清封闭生物素，这几天造模下周切片再试试