为什么5%脱脂奶封闭需要洗，而BSA、血清不需要洗呢

请叫我晓白

最近做心脏免疫荧光，一抗是生物素标记的，二抗用cy3-亲和素。发现阴性对照没加一抗（一抗也不是染心肌的）心肌全染上色了。因此考虑封闭内源性生物素，准备用鸡蛋清洗后加5%脱脂奶（含吐温20  0.1%）封闭。
. q2 e6 h. ~1 I4 j因此我想提的问题是：& m) M& K+ q) f; l9 O1 H5 w
1.用脱脂奶封闭后是否需要PBS洗，为什么血清、BSA不需要洗？
8 q. L2 s0 }6 _2.脱脂奶封闭后或者封闭前是否还需要用血清或BSA封闭？3 R& \4 d8 }4 i" a" {
3.问了很多高手都没用过我的这种生物素标记的单克隆一抗，我染的抗原很稀少，请问我选择的一抗、二抗是否有错误？
+ o/ k' }$ m" V* N4 r. c, f4.如果我做加做双标染心肌，另一种一抗是兔抗大鼠a-SA，二抗是羊抗兔FITC。那么我还可以继续用5%的脱脂奶封闭，然后洗，不用山羊血清或BSA封闭吗？
& c9 {/ ^" f( g# ~急盼各位高手解惑啊

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-27 10:42 5 z6 ?7 P7 e2 x4 [- m. g' x
回复 请叫我晓白 的帖子( {, `% i* F5 x! _0 ~' m: w
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感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。

  N  L7 N: }) ^5 M的确是avindin的二抗而不是streptavidin。这个是博士德公司的不会搞错。我看了很多参考文献都说可以用蛋清封闭生物素，这几天造模下周切片再试试

weiyepan

回复 请叫我晓白 的帖子! M0 J" W9 S5 K, @. b3 i' l$ P3 `

0 ]8 e, B. i1 R) f5 a' o* Y0 q感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。
, W; M: }# c, p" j" @* n* W而且我感觉你用的二抗是streptavidin而不是avidin，streptavidin是四聚体，不能用于封闭。除非你能找到有单体的没有标记的抗生物蛋白，那你的背景才能封掉。

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 14:34
3 \+ e; X" J. z# }. Q8 a7 a/ p回复 请叫我晓白 的帖子  S: v( Y* r. M6 ?5 |8 ^

8 @( ^' r! U; W' r1 E我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都 ...

/ p. l7 g9 P& S4 K7 \- c, S5 Z. n& C7 n多谢。我上次用的5%BSA封闭，抗体稀释液是1%BSA+0.3%triton。我这次准备用蛋清、脱脂奶封闭内源性生物素，然后用BSA封闭，试试结果。多谢你的帮助

weiyepan

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回复 请叫我晓白 的帖子, x$ I7 O# y  p/ R6 f
# W' f/ `, R4 E* l' N
我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都结合上了。这种情况在WB里面出现特别明显，和一抗没关系。+ v* c8 s* k' L- G3 e0 }6 U8 N
另外建议你的做法是低浓度亲和素低温孵育过夜，如果是压片做的话，二抗里面也加一半浓度的封闭剂，不然的话背景高的很离谱的。& S2 \# }1 c) C, b* v9 X
FYI：封闭剂洗不洗是个人习惯，我是觉得没必要洗，如果封闭剂里面有抗原的话，换一种封闭剂就行了，和洗不洗的干净根本没关系。

请叫我晓白

yuhaoze 发表于 2013-4-26 07:58 . s9 N% l3 _  V5 a4 g0 G
1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯， ...

2 m0 _* ?9 D& X, u我的实验不研究磷酸化，只是染心脏一种细胞膜上抗原/ k) h$ h0 A7 u  ~# G) e* e7 I
“不管是用什么封闭的，最好都要洗”啊？为什么所有免疫荧光的步骤都说BSA或血清封闭不洗啊？

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 11:21
5 w9 ?; s8 S/ Q) n' ?3 F5 @哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗 ...

! k* j- x6 p' E( X6 ~4 y# r. |! P
可是我的阴性对照连一抗都没加，全给染上了，而且是背景很好，这种情况是不是肯定发生了结合反应呢？如果没加一抗，那亲和素的浓度影响不大吧？

weiyepan

哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗体高，你再往下稀释1~2个数量级做做看？

yuhaoze

1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯，理论上最好，但是实际效果不一定。& `! Q% ?+ Q# z; h( a1 r- d
不管是用什么封闭的，最好都要洗。如果你的一抗稀释液跟你的封闭液一样，也可以不洗，效果不一定好。+ A1 y) A! s) `$ g
2.用一种封闭液就行了2 G4 M. a# G1 ?! k
3.很多“高手”都没做，说明你做的事情是独特的，建议你去英文文献里面找找，类似你的实验，别人都是怎么做的，照着做就行了。- x7 r1 r0 m$ R  f! E+ A
4.脱脂奶粉和血清成分不确定，如果跟你的抗原或一抗反应，就不能用。
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