为什么5%脱脂奶封闭需要洗，而BSA、血清不需要洗呢

请叫我晓白

最近做心脏免疫荧光，一抗是生物素标记的，二抗用cy3-亲和素。发现阴性对照没加一抗（一抗也不是染心肌的）心肌全染上色了。因此考虑封闭内源性生物素，准备用鸡蛋清洗后加5%脱脂奶（含吐温20  0.1%）封闭。- U+ l- o+ s/ u# B" ?* k( P
因此我想提的问题是：# c* L7 p. D* q! d/ `& q5 w
1.用脱脂奶封闭后是否需要PBS洗，为什么血清、BSA不需要洗？2 \) r$ U/ D8 P: X! F
2.脱脂奶封闭后或者封闭前是否还需要用血清或BSA封闭？
8 T1 J8 ~, k. R2 l9 O3.问了很多高手都没用过我的这种生物素标记的单克隆一抗，我染的抗原很稀少，请问我选择的一抗、二抗是否有错误？
7 C: R3 \) P& P7 E) {8 ]7 Z' O# B! J4.如果我做加做双标染心肌，另一种一抗是兔抗大鼠a-SA，二抗是羊抗兔FITC。那么我还可以继续用5%的脱脂奶封闭，然后洗，不用山羊血清或BSA封闭吗？0 ]8 @) H3 l! g2 W- w
急盼各位高手解惑啊

yuhaoze

1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯，理论上最好，但是实际效果不一定。6 U( _' N5 B# f/ I( q
不管是用什么封闭的，最好都要洗。如果你的一抗稀释液跟你的封闭液一样，也可以不洗，效果不一定好。' X( M; P9 O# P* w% u& K% K: f
2.用一种封闭液就行了
0 i6 v6 J1 T! C- G4 T3.很多“高手”都没做，说明你做的事情是独特的，建议你去英文文献里面找找，类似你的实验，别人都是怎么做的，照着做就行了。
6 n6 y+ D! D; t' d) ^( I- \+ u4.脱脂奶粉和血清成分不确定，如果跟你的抗原或一抗反应，就不能用。7 q; z2 `6 m! V

weiyepan

哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗体高，你再往下稀释1~2个数量级做做看？

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 11:21 . a" p3 V; u' S6 f5 T( A& \9 ?
哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗 ...

  c- u; N$ V7 o  _4 e3 G' Q可是我的阴性对照连一抗都没加，全给染上了，而且是背景很好，这种情况是不是肯定发生了结合反应呢？如果没加一抗，那亲和素的浓度影响不大吧？

请叫我晓白

yuhaoze 发表于 2013-4-26 07:58
: b0 u. u4 o3 Z2 q) Q2 ~1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯， ...

8 `0 Q, i& r2 g3 Y* }* s8 O8 Z
我的实验不研究磷酸化，只是染心脏一种细胞膜上抗原: s# L+ z  L- M* @" ^( G
“不管是用什么封闭的，最好都要洗”啊？为什么所有免疫荧光的步骤都说BSA或血清封闭不洗啊？

weiyepan

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- C. f- R- x1 ?
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0 G  w6 V. `; h$ ~% s, f
- g, N1 G& Q8 O. \9 k) O$ j$ a我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都结合上了。这种情况在WB里面出现特别明显，和一抗没关系。
0 k" Y+ c4 X  Q- E; A7 Y另外建议你的做法是低浓度亲和素低温孵育过夜，如果是压片做的话，二抗里面也加一半浓度的封闭剂，不然的话背景高的很离谱的。
4 `. n. Z. W3 x% W- pFYI：封闭剂洗不洗是个人习惯，我是觉得没必要洗，如果封闭剂里面有抗原的话，换一种封闭剂就行了，和洗不洗的干净根本没关系。

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 14:34 4 P+ B. u3 M6 I! |+ I# Z- X" c; t4 A
回复 请叫我晓白 的帖子+ b3 v3 Y$ s, l9 M
' V: c- P* Z( e6 R  U& C; k
我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都 ...

8 }# P9 g  E8 i' r+ u6 Y# U
多谢。我上次用的5%BSA封闭，抗体稀释液是1%BSA+0.3%triton。我这次准备用蛋清、脱脂奶封闭内源性生物素，然后用BSA封闭，试试结果。多谢你的帮助

weiyepan

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( U5 r- e; Z& z6 }4 X" ]' j2 V
' A7 y  R( h# |0 A) Z5 C感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。- ?; K2 d! z6 P2 h" Y
而且我感觉你用的二抗是streptavidin而不是avidin，streptavidin是四聚体，不能用于封闭。除非你能找到有单体的没有标记的抗生物蛋白，那你的背景才能封掉。

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-27 10:42
* Q! ?6 N% [2 l) y9 V' l$ @" f  w' q回复 请叫我晓白 的帖子
! Y3 @2 V) n( F: ^6 N) Z5 L7 s! E1 p1 V
感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。

' h' s0 b; v: f4 X; T的确是avindin的二抗而不是streptavidin。这个是博士德公司的不会搞错。我看了很多参考文献都说可以用蛋清封闭生物素，这几天造模下周切片再试试