细胞冻存与复苏

mtdj1314

0 |; n/ e7 D4 T' y1 G- {7 b/ k1 w6 |* N' Y
       我养的是脐带间充质干细胞，取p4代冻存，冻存前细胞开始融合，采用FBS：DMSO：含10%FBS的DMEM=3:1:6冻存体系，T25瓶子长到90%冻存，冻1支，1ml。冻存程序是4度30min，负20度60min，液氮表面悬挂过夜，次日复苏，37度水浴，2min内融化，转入已经加了8ml完全培养基的10ml离心管，1500rpm离心5min，完全培养基重悬后种瓶，复苏贴壁率才70%多点。
& @* s. I% [0 i# C7 W3 t4 S7 C       看了论坛不少研究者的回答，基本都在80%以上，好的还有90%多，而且细胞冻存密度更小，有一个T25瓶冻2支，复苏时候1支种2个T25都还很好的，很讶异。都说经验要靠自己的双手去探讨，但是在摸索数次后，我还是想请教各位，在冻存与复苏的过程中，还有哪些细节会影响到最后的复苏贴壁率。" `  N7 B1 ~  @3 h
      我自己琢磨以下几点：
0 a. G* ~) q) ?4 A" g, [8 z# W8 P' s      1、细胞采用第几代冻存？
. P- p$ ]: s$ E1 Q. ^      2、冻存前细胞汇合度多大？
0 {8 G3 r* L& M6 g5 W' Z& {      3、冻存体系比例？加冻存液的方法？/ F: o. b4 B, A' Q9 ^
      4、冻存细胞的程序？包装？
# ]8 `* D& d  y      5、复苏细胞时候的手法？
" ~( Y- ]0 x' V6 A/ ~6 \+ a      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？  J! D* G( f- i/ O, Q
      7、我想知道各位在细胞复苏后，大约多长时间达到上述80%、90%贴壁率。

加贝

我一般是冻存长到90%的6cm皿，细胞消化、离心，去上清，用900uL的胎牛血清重悬，移到冻存管中，向管中缓慢滴加100uL的DMSO，混匀，放到冻存盒中，置于-80°C冰箱。复苏后细胞基本都能贴。我养的干细胞比较娇贵，所以用900uL血清，有的细胞用300uL血清+600DMEM就行了。

184lj

1、最好冻存5代以内的细胞；
% h2 u1 ?6 `$ q% w2、细胞汇合度90%左右；
: Q2 j  W$ z' T% o; y3、冻存液现配现用，冰浴配置，要提高活率可以提高血清所占比例（复苏时，培养液中血清含量也要相应的提高）
# r5 h) }4 @1 [/ N) P4、4℃ 30min，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；* n: q5 T: r. J, k& b! a
5、解冻迅速置于，37℃水浴，管内留有小冰渣即可；
7 s, F+ N5 ^# }4 o6、冷冻前、复苏后，培养器皿规格最好不要变。

mtdj1314

回复 加贝 的帖子7 F2 ]. N+ f# L4 x( N

! F, E' K: l0 o9 L; W你好，谢谢你的回复。冻存盒是什么牌子？什么型号呢？这个我一直没有用过，想知道详细点。还有我的细胞融合了，边界不清晰，是否也不太合适？

mtdj1314

回复 184lj 的帖子1 J" N3 N" p. T

' B8 p0 _# O* j5 R# A# Z你好，谢谢你的回复。我有几个问题2 |6 n/ s" a8 Y$ l' \4 X6 Y3 }, y+ Q
1、你们脐带间充质干细胞可以养到多少代？2 N) {8 A) K* d
2、我的细胞融合得边界不清晰了，是否有问题？* z. ?4 L1 @1 I" v0 P
3、复苏时候血清大概多少？20？& ~! G- V- Y3 ?% L, m
4、冻存时候不需要经过-20度？还有放置4度和-80度的时候是冻存管裸放，还是放入冻存盒再放？冻存盒品牌型号能够告知？& ?, w, W! m% N  |) R! p1 `" d
5、你们一般复苏贴壁的有多少？: M2 L3 s9 L$ Q& A' B6 t& I
问题有点多，麻烦了

cantonchn

  o( @4 o/ j' `( o9 [( U- L# p( ~' m
MSC理论可以无数代，但是最大10代就极限了，5代应该就开始衰退和分化了，最好的是2~4代之间。

jiguojie87

     1、细胞冻存一般取5代以内的细胞比较好，我们都是用2代的。) U% S/ m; k6 x7 ]- G% n
      2、冻存前细胞贴壁达到90%左右，如果时间再长会影响细胞的活性，但是时间短的话就太浪费了。$ S! o0 ]8 c) z2 l! u3 @) ?
      3、根据细胞量冻存，大概1*10的7次方一管，每管1ml。冻存液：血清：DMSO：DMEM=3:1:6冻存体系,我们现在改成血清替代品了。配好的冻存液最好预冷使用。
! Z$ C  I; j9 H( Z! M! R      4、4℃ 0.5h，-20℃  2h，-80℃ 过夜，第二天液氮保存；( f9 v9 G4 {- u9 f
      5、复苏细胞时候39℃复苏，时间尽量短。
. p" R" r% e. g; s3 }4 L1 J9 |      6、复苏细胞种瓶/种皿的密度？& z1 g) M, L6 _2 t+ L0 l) m1 e( q+ A7 N2 U9 R