最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

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& B, w- D- [; }7 i
* H) T# Y2 T/ Q我的试验目的和你差不多，我想表达的是带His tag 的protein，不过我想问下你回答中的"gst+ve的样品 " 是什么东东啊 ，ve代表你的蛋白质？
" P; M' z9 j% j3 ?
9 L% ^& d$ j. @* b还想请教一个关于competent cells的问题，BL21 和 BL21 pLYsS 在后期细胞裂解上的主要区别是体现在是否表达溶菌酶上嘛？你是根据什么来选择这两种感受态的，最近在犹豫是否改用
4 O' J; R4 E: _8 u6 e% a* B) zBL21 pLYsS 已方便后面的超声波裂解，自己手头有了 BL21 和 溶菌酶。期待您的回复

cyberpig

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  B3 C5 q) p7 q" \# O: Q$ A9 I4 H0 _; q* B* k( R& M) {. u- F
我做western時沒有做內參，因為我想表達的是帶gst tag的protein, 所以只用了已知gst +ve的樣品來做外參。而做sds page時，我則用了未誘導前的lysate做內參。

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子1 s7 U  _6 J5 {, A4 D- t
) I3 T6 k3 n+ a2 K" V3 Z  x
我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。
, w) e( v# R) r: O) F( J7 X1 |想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   : y! n- l1 I+ R! X2 \! P% J. u, U

/ X0 }2 r7 w8 k8 f7 K) `# e还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？

Andyhigh

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8 Y, @5 ~$ N. |3 Q" n+ C
8 s0 q  s, U4 r  A3 N  ~- y我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。# S2 z# ~9 k3 |: G, \/ d. u
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。
! j4 m6 b2 T4 ^; ?; r  r& ?
$ l" J; u+ N/ s4 B+ ?可能失败原因：
1 F4 v7 {4 t2 G0 D$ C/ G$ k2 e- C1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。- ~8 f$ z' r) _# D% u7 B2 Z. |  I
2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序  
3 h" s5 |6 {4 o
/ ?% \& j3 J9 T2 w$ t; u# h% B* r1 p6 t心得:8 S- ?# x6 `) j. l
1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。
% u& u  H; \! j& L! C2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题
' N9 o6 ~+ j: U; }* X5 b3.做阳性对照, {5 ?5 h, w( m0 }! F

- }0 K7 c$ H, c! D在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···' P( h, d. p4 D0 |: s, f
    * P1 I, k9 G8 \$ b; `
  

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子1 l2 }2 t6 s3 S/ w

+ h) g( u. M. D, Z! h; C建议楼主- m6 Z9 D8 f* S& O
1、裂解液不要加太多，如果蛋白浓度很低，几乎是看不见条带的，于冰上（或4度）裂解，碧云天的裂解液我也用过，本身就是有点粘稠的。
6 ^3 F$ A6 {0 ?' X3 g0 F# y$ M8 G% Z2、蛋白变性理论上100度10min，但我也试过只煮沸5min的，似乎也没啥问题，这里建议楼主检查一下loading buffer是不是有问题，我之前有一次杂不出条带就是因为loading buffer导致蛋白变性出了问题。
% i( m' u* ?3 k; F: K$ C" v3、全蛋白做考染，个人感觉意义不大。
( k3 Y( `4 _/ l8 L8 @9 X4、关于转膜，marker能转过去，理论上蛋白也是可以转过去的。6 L* U% p9 K/ K& u4 ]/ C8 H7 Y
5、一抗的质量是做WB最重要的，楼主最好先确定抗体有没有问题，如果不是，那就是蛋白提取或变性出了问题。

cyberpig

Andyhigh 发表于 2013-5-24 23:45 4 M. |4 s* u  `0 z  x6 ?
回复 cyberpig 的帖子" _/ J+ W& J. F$ l. n* O
# \9 k: R2 {9 `( O9 e! E7 s
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？ ...

6 a- J# Z: S/ Y8 iBL21, pLysS也有用~

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子! D/ t$ Z8 Q& j( F) P
# X- Y& [% I1 g/ G. d( ?
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

cyberpig

6 c) v! V6 j& \% X6 n" F3 U9 ~4 b

Andyhigh 发表于 2013-5-24 21:43
. }% z( ]: h+ x9 O6 j0 D7 h, b: m回复 cyberpig 的帖子
: w/ p, N1 @: V4 F$ Z' i- f
& B. o/ ^; i3 j楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？

2 M5 u0 [4 U  v  {: u# B
; g# L$ A# C" L! w! g我也是做IPTG induction。有些做出來了，有些做不了，要再試一下其他strain的competent cells。

Andyhigh

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" I8 W: E" S0 F/ L/ h" ~6 R
- }( K8 a$ L7 E0 e" \9 |6 ^楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？
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