最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

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: G$ x# L* V* a; h0 k4 V" l9 R$ k" q+ w
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？6 _5 u' @8 r4 I! Z

cyberpig

3 N1 i. }- W. Z" d5 y

Andyhigh 发表于 2013-5-24 21:43
+ ~0 A: R# J1 ^% O; `回复 cyberpig 的帖子. Z- e( g  y2 _) v! X
# k" a: A  F/ Z: q$ ^8 w/ R- W
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？

! f9 H  S" o2 {& J1 j
. [6 ?6 l( I9 `我也是做IPTG induction。有些做出來了，有些做不了，要再試一下其他strain的competent cells。

Andyhigh

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) L2 L; W9 l0 ]% ?" i5 I5 _" J: L  b" `: F% `. I8 D
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

cyberpig

Andyhigh 发表于 2013-5-24 23:45 * m/ r7 e7 _5 |. \7 o% O$ p  y% U
回复 cyberpig 的帖子" l- Y+ {6 Y7 G
- [9 b0 f1 ?& R# N: T
那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？ ...

* r) J3 b2 t1 T; x4 E
BL21, pLysS也有用~

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子5 z- b& G2 H* [+ p5 o0 Y

. p1 o1 P# P" X4 D) ~建议楼主- I( F9 K  {( _8 n1 q
1、裂解液不要加太多，如果蛋白浓度很低，几乎是看不见条带的，于冰上（或4度）裂解，碧云天的裂解液我也用过，本身就是有点粘稠的。, ^% o$ I! ?8 [# w$ W. l
2、蛋白变性理论上100度10min，但我也试过只煮沸5min的，似乎也没啥问题，这里建议楼主检查一下loading buffer是不是有问题，我之前有一次杂不出条带就是因为loading buffer导致蛋白变性出了问题。. c' U: R/ q/ e8 f: ?
3、全蛋白做考染，个人感觉意义不大。
+ x+ A- k& n6 _# K9 c4、关于转膜，marker能转过去，理论上蛋白也是可以转过去的。
5 @; M1 a3 s- K# x5 j. z. F/ N. `5、一抗的质量是做WB最重要的，楼主最好先确定抗体有没有问题，如果不是，那就是蛋白提取或变性出了问题。

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。
( t! n& z+ t* m' A7 I' w, |: }6 {  I
可能失败原因：) G4 N) V* g9 U" @- }# a- N
1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。
" o% C2 L$ j! X& d9 J% B% T2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序  * J  K5 V/ t  _% P6 T& k
! x4 I$ `/ l6 p, }; o1 B- q) R
心得:
  @) t: V1 k3 h/ U: u+ K) c1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。5 E' E" s: q) f- k# h9 g- l
2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题
* _  P, ?# u; Q" ?3.做阳性对照
$ W2 v8 G# |4 a# s2 p
8 @8 @; O( _, ]8 i7 Z在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···5 f# w, G" a8 y. X
   
- k+ A# A, _2 f  U# u  

Andyhigh

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, i+ e/ y5 {+ f9 p1 l4 ]: G6 g- ?, u, k) W; C2 l
我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。
( p2 h5 y9 h  |想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子! z, O$ W* \3 K" S+ W( |$ I

/ _1 d! S2 A& s; d% ]% E/ H我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。
' s+ n2 Y( q/ i1 T1 n+ t! s. i' k! c想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   9 T& D3 ^! {7 V  V% \% M8 [; _
* Q; m6 G" H6 Y+ ?8 L
还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？

cyberpig

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& s: ^' R6 ^. K" }$ M1 X" O# G% c8 f
我做western時沒有做內參，因為我想表達的是帶gst tag的protein, 所以只用了已知gst +ve的樣品來做外參。而做sds page時，我則用了未誘導前的lysate做內參。

Andyhigh

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7 o) g5 ]4 U$ Z+ Y
3 R2 P2 O6 s! G% Z2 c4 G我的试验目的和你差不多，我想表达的是带His tag 的protein，不过我想问下你回答中的"gst+ve的样品 " 是什么东东啊 ，ve代表你的蛋白质？
2 E8 k) P$ \4 N* s* b% S
6 w8 l5 N1 W9 j3 k" ~4 E9 {还想请教一个关于competent cells的问题，BL21 和 BL21 pLYsS 在后期细胞裂解上的主要区别是体现在是否表达溶菌酶上嘛？你是根据什么来选择这两种感受态的，最近在犹豫是否改用7 _+ v$ z! O1 H/ F9 K
BL21 pLYsS 已方便后面的超声波裂解，自己手头有了 BL21 和 溶菌酶。期待您的回复