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本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。
7 x; b3 B2 v* E- R+ x1 { B7 h9 b8 b
8 p& F1 ~. G% ?; a& m自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：1 V1 E+ Z( \+ x4 X6 N' P
4 s9 q, G+ o; h1 x v1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。, u v0 q/ m$ Z! H I+ ?8 e
备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF
5 h' n- Q. C8 @7 O$ G 疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？
2 y% n$ |' ~% f) y& c4 I0 k2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。
2 z% k" e3 {+ A! D3 L8 J$ ?( d$ { 疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？7 W* \7 {( \$ L1 ?: {6 K1 x4 [3 }
3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说 差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。
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P, l: b( a# R, s# a! @于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin
7 d D3 [# g# S9 l$ H4 @/ m+ _1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解 变性。
P0 f& o9 q" P4 P e, K. Y. T2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v 分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。
' P2 G2 x0 m0 v5 O3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行 转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离 及 形状）
6 u$ e# S9 t) d$ \* Y: U4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做7 v4 q; i9 ?( F5 j; q" y+ j/ ^
5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜
8 B% x0 e3 p, g+ _0 z* j3 Q6.一抗孵育 二抗孵育 暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ··· 失败！: O; b' q$ G$ W; U0 b) C. q
7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题
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实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低$ e5 X+ B/ e/ C/ ~
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不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的+ r9 m5 A S6 G# b8 G
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发表于 2013-5-23 23:03
发表于 2013-5-24 10:30
