最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。2 ?2 T# v" C$ N' u

' ?! M% H, T6 t3 r! N自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：
$ l2 m6 s' {- J: O% R8 x% L; u8 S( _9 D9 Y& s: V; D% {
1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。) o' ]) `! g; Z2 Y* ~9 ~, c" n
                         备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF, L+ Y. \% m( Y" B6 a6 T) M
                          疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？5 u: ~8 a0 m2 S* o& R7 k
2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。
" K5 l; f/ w, h6 m4 X                         疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？: L' `7 @: |, k6 I  o. u2 I/ R/ ]
3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说   差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。
3 Z$ J: C& j! P& r2 P
, {( L/ K: m* F* D9 X6 i/ R' G: }于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin- u0 f! e2 a+ [0 d
1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解  变性。7 E6 W' f7 `( V. o  ]
2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v  分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。
$ Y& L; v. C. E" l/ A/ N3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行  转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离  及 形状）, `3 e5 {/ [' g0 Q- q
4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做
* b6 V- x; C& L4 F5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜4 D% t1 C: e$ o' f
6.一抗孵育  二抗孵育  暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ···  失败！
- y) H' h; `" h& [2 F5 Y5 U" G, d7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题1 y( R: m/ y# s8 r6 B. r

- z4 x5 ^+ J% z3 O: L实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低
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不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的
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Andyhigh

回复 fengjh100 的帖子+ {( e! {2 U  T2 x! ~# g  l, `

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fengjh100

* ]1 P+ s% G& h' R9 J+ k5 B5 p  W! [, N
根据楼主情况，我觉得提取蛋白是关键，提取蛋白有些环节是不能忽视的，能保证在以下四点没有问题，基本上是可以使用的：1是在冰上进行；2是裂解充分；3是变性良好；4是定量准确。跑WB也有很多环节，各个环节都可能导致没有良好的条带出来，建议行点杂交实验摸索下。至于用丽春红 染色 ，个人感觉还是不怎么靠谱。所以建议：重提蛋白（最大可能是蛋白提取的不好）。至于电泳和电转，分子量不大的话可以低点的电压，电泳时用250毫安就应该够了。很多细节可以认为避免的应该注意。祝早日跑WB成功！

Andyhigh

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# o* `% I8 @7 d- }) p2 \
* G+ d- A$ n1 j! ~. t5 \好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

Andyhigh

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0 P) x  L3 `. g. ?/ w$ d5 D" {0 l4 X8 G, I* J$ n3 q' p
好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

hbs08230

在转入BL21以后需要做一次small scale的测试看看表达量。: h" O$ Q1 j8 g& _: }
在涂了BL21的细菌板上挑5-10颗形状规则的克隆，用培养液摇床上过夜培养。第二天，每一颗克隆取10ul+10ml培养液，加上两个control，然后上摇床培养，直到OD值达到0.8，然后一个control不加IPTG做negative control，另一个和所有克隆一起加0.2M IPTG 做positive control。摇床4-6hrs让其充分。 所有培养液上离心机去除上清，留pellet。所有pellet各加1ml lysis buffer后vortex均匀，超声破碎3min，5s on and 5s off。一万转离心10min，收上清，收pellet。此时的pellet再加入1ml lysis buffer后vortex均匀。准备run gel。
1 n  c5 ^1 U" B0 Q$ c上清的上样量：20ul，pellet的上样量：5ul
7 M  |& ^. [/ [7 m* c( A7 W( Y7 b加好loading buffer，95度10min。1 _2 ^. x/ i) U8 n$ t+ K* p( G$ u
只要你的marker跑好就基本无碍。% q/ }8 F( C4 Q) Z/ e" [7 i7 H- ?
考马斯亮蓝染色至少20min，脱色20min一次，共换3次后加多些脱色液通宵摇床上浸泡脱到无背景色。4 _( K' D5 K- d/ H" u1 d
有negative control做指标，在你想要的KDa位置上蛋白斑越大表达量越高。如果没有negative control做指标就不好说这个位置的蛋白斑是不是被IPTG1 ^: p0 ~, s) @
induce出来的了。' C5 @2 h3 U3 V
如果上清中没有蛋白斑，但是pellet里有就说明超声破碎不够。

cyberpig

GST +ve (positive) 指已知帶GST tag的protein (作western blot外參)。我想表達的東西同時有His和GST tag的。
) J' \) E4 k" D, q
. @% ]# P. _6 {# O( _; R+ x( T1 [" NBL21和pLysS的分別應該只是有否表達溶菌酶，而我選這兩種是因為我們實驗室最常用這兩種。做IPTG誘導的話，它們的分別不大。但做autoinduction的話，pLysS不能用就是了。如果這兩種都不行，只能試一下rosetta, C41等。* M; m2 d) j* Y% t
; Z) @9 e& @; ]/ C2 ^1 {6 i7 G  I

DNAngle_RNA

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, V% ^6 F0 J0 {恩，表达纯化，再做WB鉴定就可以了

Andyhigh

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8 ]; l& s* J5 Y. \  O1 o
5 x6 N, y. I. H3 t' p  ~: Y# y哦 ，我就是想用原核系统表达并提取 纯化我的目的蛋白

DNAngle_RNA

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" }4 e" g! @; s) o' U5 J好像做原核表达鉴定蛋白不用做内参吧，至少我没听说过，一般来讲做SDS-PAGE鉴定就可以了，严谨的话再做WB