最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。0 f( j0 H/ }/ ]8 q+ g( ~2 `
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自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：7 a/ @$ B+ K* {. n$ P2 W; {
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1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。
' y5 m, [; M( E" T2 I9 l. M+ D                         备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF
/ ?- W* @6 |  S, P& h. e                          疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？
# W! Q) b5 ]+ G5 z/ J3 y" u2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。4 V; w- U. _4 U
                         疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？! O' e- C$ [) s. a
3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说   差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。/ C/ G4 z; U3 c0 F& ~

: o. K) _  B) C0 h" p于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin
: M$ u( L1 M: g3 J' K1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解  变性。
% Z6 _9 R7 {3 z/ S5 V. s2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v  分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。) _) K) O7 B* Q+ q& A, y. {$ o
3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行  转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离  及 形状）( V4 H+ n( |5 L) R( ?3 r( ?2 J
4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做! [# q$ g/ }9 c
5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜
( f: q; l6 r9 J. C; Q' J- V' G+ H6.一抗孵育  二抗孵育  暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ···  失败！
/ I$ m, w/ ~/ R  k, E7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题
' y0 ]! @% _1 u. m
  ?9 |7 P8 T. P9 K$ g! k% j& s4 p实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低
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不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的
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Andyhigh

同时，也分享下自己找的一些资料吧 上海之江公司-western blot方案.pdf (233.69 KB)

2013-5-23 23:19 上传

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WesternBlot讲座2012.pdf (20.32 MB)

2013-5-23 23:16 上传

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Western-Blot操作流程.pdf (214.51 KB)

2013-5-23 23:11 上传

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ECL-western blot 发光说明书.pdf (147.95 KB)

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abcam-protocols-book-chinese.pdf (7.39 MB)

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! W: E$ Y) [' J8 W! ]' b9 I
0 e" h; p% V1 d' i5 B2 b4 \' u( L现在发现有几个都没有认真看，嘿嘿！

Andyhigh

咋没人回复呢  

Andyhigh

回复 加贝 的帖子
5 R; B" M3 D& v) k8 c
, n+ [$ {4 Q9 Z* p" h; A) N下次想把沸水浴的时间改成10min，上样缓冲液是按照样品量的多少来决定的。我的目的蛋白是40-50KD左右，电流比较小，是为了防止产热过大。Marker转到膜上去了，这能否说明这个转膜的过程没问题呐？

Andyhigh

回复 yangcy-smile 的帖子9 ~! h' G, t1 h8 Y) G  S6 ?! h6 h
2 j- V* H" b6 K$ p
现在自己也怀疑，可能是蛋白降解了。之前，提取蛋白时没有在冰上操作，也没有严格按4度离心操作。谢谢啊

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子) M. S- O0 G% N
/ U, w+ O3 U# s% y& V$ o
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？5 _2 k6 J8 ]7 z- V

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子
5 H7 i, I  K7 C! |6 g
7 U$ D6 l: ~# T& P那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。
3 c7 E* Z; K2 c; p* U  `& q7 Q- u: C) k. O
可能失败原因：
' t4 H9 b( S% Q' x" L3 c1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。9 `9 ?+ G& ^5 ?- Y& Z, \$ w8 m
2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序    x8 g. `, {6 _8 A" j7 \

# @5 b& H1 A# ^4 Q8 I4 k& H心得:
; r3 H3 M" q& A; q: `, h+ S1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。
  I! L4 Q/ v9 s3 ]- z0 z: ?5 _2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题. }, @$ b5 M% \! A. i* |9 n
3.做阳性对照
1 J" M6 j4 W) ~- k1 @2 [4 Z/ v& i
在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···! i9 g9 V1 b4 N8 ]# Q: x
    , `" Y8 V! ^  Z/ W8 l0 u
  

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子
  c. b1 i, c: w" y$ ]3 @9 K
( S- R  Z# _6 m) T: y6 E我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。$ H. h  w; r6 K. ]& P3 D! K
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子
0 X* S, W" c  L7 O. I) ~4 q+ A6 z6 Q  N
我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。
) _" _0 y. M; h8 C# d* n% v6 [9 u想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   
- d5 [' g" N% u  r
5 p* c# c( O" A4 Q( B5 G* p- g还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？