最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。
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自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：! U' `, m0 z: S: X
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1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。
1 a7 i1 L- F6 n+ `                         备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF5 a1 a& x% ^$ {4 E$ q
                          疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？9 f7 v8 w  D4 _
2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。9 Z  B* e! p# ?" s8 ?5 r4 O! p; n8 ?
                         疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？' O4 }: @  w8 Q1 B2 f
3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说   差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。
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于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin
' o  ?4 H4 W# T% E; t1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解  变性。: B" P% G9 b8 G) Y7 a" }5 _
2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v  分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。4 q. u6 s. L% Z& j
3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行  转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离  及 形状）' p+ d9 ^! T: k  o+ }
4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做2 t1 p8 Q) z, B' X1 ~/ Q
5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜' m% K; c  y  w8 Z4 W; V* {
6.一抗孵育  二抗孵育  暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ···  失败！
; w8 [, [4 Y5 z; x9 c/ _2 V# K" T7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题
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实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低
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不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的* z* @5 h, p8 c( \0 z  h1 x

Andyhigh

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fengjh100

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1 ]) T) g8 J8 V4 C8 d# M$ a根据楼主情况，我觉得提取蛋白是关键，提取蛋白有些环节是不能忽视的，能保证在以下四点没有问题，基本上是可以使用的：1是在冰上进行；2是裂解充分；3是变性良好；4是定量准确。跑WB也有很多环节，各个环节都可能导致没有良好的条带出来，建议行点杂交实验摸索下。至于用丽春红 染色 ，个人感觉还是不怎么靠谱。所以建议：重提蛋白（最大可能是蛋白提取的不好）。至于电泳和电转，分子量不大的话可以低点的电压，电泳时用250毫安就应该够了。很多细节可以认为避免的应该注意。祝早日跑WB成功！

Andyhigh

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好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

Andyhigh

回复 hbs08230 的帖子& o, q' U$ G+ H& N

, o) o: H" Q5 l7 @2 X% e- C7 o好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

hbs08230

在转入BL21以后需要做一次small scale的测试看看表达量。0 Z& m7 a7 f0 S7 |* |
在涂了BL21的细菌板上挑5-10颗形状规则的克隆，用培养液摇床上过夜培养。第二天，每一颗克隆取10ul+10ml培养液，加上两个control，然后上摇床培养，直到OD值达到0.8，然后一个control不加IPTG做negative control，另一个和所有克隆一起加0.2M IPTG 做positive control。摇床4-6hrs让其充分。 所有培养液上离心机去除上清，留pellet。所有pellet各加1ml lysis buffer后vortex均匀，超声破碎3min，5s on and 5s off。一万转离心10min，收上清，收pellet。此时的pellet再加入1ml lysis buffer后vortex均匀。准备run gel。 ! s( a: Y7 ?) f3 a. H
上清的上样量：20ul，pellet的上样量：5ul: C# G: q( h0 e: T. n$ P/ @: f: [
加好loading buffer，95度10min。+ b$ F) W( F. g0 f  l, A7 d
只要你的marker跑好就基本无碍。
* @+ v* i- m0 o/ ~" `考马斯亮蓝染色至少20min，脱色20min一次，共换3次后加多些脱色液通宵摇床上浸泡脱到无背景色。
. E0 _" \0 L4 U5 X! z# [/ X. B有negative control做指标，在你想要的KDa位置上蛋白斑越大表达量越高。如果没有negative control做指标就不好说这个位置的蛋白斑是不是被IPTG
( P% Z! C3 Z  H, K" z- C" G% [' `9 Linduce出来的了。
7 R: W; m6 [, N7 T9 r5 ~如果上清中没有蛋白斑，但是pellet里有就说明超声破碎不够。

cyberpig

GST +ve (positive) 指已知帶GST tag的protein (作western blot外參)。我想表達的東西同時有His和GST tag的。
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BL21和pLysS的分別應該只是有否表達溶菌酶，而我選這兩種是因為我們實驗室最常用這兩種。做IPTG誘導的話，它們的分別不大。但做autoinduction的話，pLysS不能用就是了。如果這兩種都不行，只能試一下rosetta, C41等。9 a! v0 ]) V! u: \. {5 ]
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DNAngle_RNA

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恩，表达纯化，再做WB鉴定就可以了

Andyhigh

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哦 ，我就是想用原核系统表达并提取 纯化我的目的蛋白

DNAngle_RNA

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好像做原核表达鉴定蛋白不用做内参吧，至少我没听说过，一般来讲做SDS-PAGE鉴定就可以了，严谨的话再做WB