最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子+ D& h1 H" h# `# p5 }
2 J# x8 d) e  I5 j# x
楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？2 p9 R9 Y# Y6 V. F1 g+ b

cyberpig

6 T; K. }2 I6 v+ U

Andyhigh 发表于 2013-5-24 21:43
0 U, t0 E& V- m% b2 m; [; B回复 cyberpig 的帖子) P9 k( I# k" I# x4 Q

' k! U. x6 o6 w* b4 i楼主好建议，想问下你做出来了嘛？你做的也是蛋白诱导？

6 F0 t& ^: {4 J+ d4 R3 u( f- d8 v' p: d. w) d# z9 L
我也是做IPTG induction。有些做出來了，有些做不了，要再試一下其他strain的competent cells。

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子
& j" y) |. A& E+ [
6 A" U0 U3 _$ \那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？？？

cyberpig

Andyhigh 发表于 2013-5-24 23:45 : r9 m% H: y; H" e# t
回复 cyberpig 的帖子
$ k$ U: e" n7 C' P9 f) x
% [; q: P* I* Z那想问下，你的感受态细胞用的是什么？是BL21（DE3），BL21(DE3)pLysS，还是其他的？ ...

3 q6 m! g4 h( C8 o# T/ E* P
BL21, pLysS也有用~

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子6 e3 X# D% p$ x, r( }- k
# t4 O0 S6 X; c9 U( P
建议楼主9 {9 I$ _3 |/ L- }9 V! g) S* f
1、裂解液不要加太多，如果蛋白浓度很低，几乎是看不见条带的，于冰上（或4度）裂解，碧云天的裂解液我也用过，本身就是有点粘稠的。7 i! e6 u2 M0 q/ o/ \1 Y% F
2、蛋白变性理论上100度10min，但我也试过只煮沸5min的，似乎也没啥问题，这里建议楼主检查一下loading buffer是不是有问题，我之前有一次杂不出条带就是因为loading buffer导致蛋白变性出了问题。
; h; o' Z) H8 a+ {5 k; L2 t3、全蛋白做考染，个人感觉意义不大。
0 f1 h1 G2 l8 ~# b% E4、关于转膜，marker能转过去，理论上蛋白也是可以转过去的。
+ n1 x& Y2 E5 y1 v! A* F! E8 h" a5、一抗的质量是做WB最重要的，楼主最好先确定抗体有没有问题，如果不是，那就是蛋白提取或变性出了问题。

Andyhigh

首先谢谢大家，其实前天就把内参跑出来了，由于时间原因，就没回帖。4 Y/ [7 b" J- i! k( P0 t) ~/ c6 I
: P2 [, k/ m* L
可能失败原因：
! l5 ~# ~6 m% Z2 V1.TBST没有调PH，就直接用来稀释二抗，可能是导致本次试验的原因。2 `' O  Z- |+ D) z! y. x4 _9 B
2.一些操作上的细节：如  是否在冰上裂解获取蛋白   转膜的条件及时间  滤纸 胶 膜的顺序  # }  b2 a# d: w+ b/ Y
9 u- O; J! `6 V  H4 a4 W
心得:: @' y+ _- H( V$ b
1.如楼上所说，做全蛋白的考染没有什么意义；如果按楼上某个人收的，做个诱导前后的对比，还是有点可行性的。
" b+ k7 f1 ^7 B0 p. I& C9 z2.事先检测一抗和二抗  发光试剂是否存在问题
4 r) k' `6 ~+ a' a% p3.做阳性对照
  h! C9 p* J% z+ p5 p4 r1 k1 ]/ U( J' a2 A
在这里还想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？  新手，请原谅啊···% f" M; w- d3 K
    8 n( ?( ]4 p' K' Y# s8 l7 \
  

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子
( i2 ]1 \& d: U% U7 m
+ @+ q) ?& u; Z1 _5 P, T: d我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。. ]$ D6 z0 F8 y( K: s- u( s5 Y
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin  

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子
$ S3 x. ]8 X7 z2 \$ i9 D6 c: f3 R+ |/ }
我用iPSCs做阳性对照，跑了个Tublin内参，结果WB呈现阳性结果。9 ]; L, r6 G4 ?" @! u: c6 P
想问下，用细菌（如 大肠杆菌 BL21（DE3））,其中有哪些蛋白可以做为WB的内参？ 我手头有B-actin  和  Tublin   
5 S6 C; K" M3 A* q9 \9 r1 H. l2 O% ?1 {* g( c+ R
还有其他内参嘛，或者有相关文献嘛，能给我发下不？

cyberpig

回复 Andyhigh 的帖子
4 T1 e7 Z/ {; v
7 u' f, |9 i: o5 K& B我做western時沒有做內參，因為我想表達的是帶gst tag的protein, 所以只用了已知gst +ve的樣品來做外參。而做sds page時，我則用了未誘導前的lysate做內參。

Andyhigh

回复 cyberpig 的帖子( d4 o9 {  ?$ G! k1 x" E

8 j5 @+ f4 F4 e1 \' u我的试验目的和你差不多，我想表达的是带His tag 的protein，不过我想问下你回答中的"gst+ve的样品 " 是什么东东啊 ，ve代表你的蛋白质？8 z) Y, h; Q* e5 b) }" y) o

8 W. |# \3 O$ H还想请教一个关于competent cells的问题，BL21 和 BL21 pLYsS 在后期细胞裂解上的主要区别是体现在是否表达溶菌酶上嘛？你是根据什么来选择这两种感受态的，最近在犹豫是否改用
1 @; D$ |) C% O: _9 JBL21 pLYsS 已方便后面的超声波裂解，自己手头有了 BL21 和 溶菌酶。期待您的回复