最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子0 b) d9 y: A, u5 W0 d6 g8 n  t

& m8 g; m1 @2 o% m$ G% q好像做原核表达鉴定蛋白不用做内参吧，至少我没听说过，一般来讲做SDS-PAGE鉴定就可以了，严谨的话再做WB

Andyhigh

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+ F5 L- B( Z5 p/ c6 f9 H# n5 e0 |* m; N! m5 [
哦 ，我就是想用原核系统表达并提取 纯化我的目的蛋白

DNAngle_RNA

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9 ]( o0 \0 P# i* H* T) b$ e3 ?2 B4 B7 R! |% w1 z4 c9 s& q" T
恩，表达纯化，再做WB鉴定就可以了

cyberpig

GST +ve (positive) 指已知帶GST tag的protein (作western blot外參)。我想表達的東西同時有His和GST tag的。, I9 r" o" o6 m# t: {" j

5 B! }( w0 N: p! TBL21和pLysS的分別應該只是有否表達溶菌酶，而我選這兩種是因為我們實驗室最常用這兩種。做IPTG誘導的話，它們的分別不大。但做autoinduction的話，pLysS不能用就是了。如果這兩種都不行，只能試一下rosetta, C41等。
3 D. Q/ m; A3 i% D. @$ ^% Q/ t
/ P5 ]7 u5 n4 s( w# t

hbs08230

在转入BL21以后需要做一次small scale的测试看看表达量。
2 N7 E4 ?$ M& j在涂了BL21的细菌板上挑5-10颗形状规则的克隆，用培养液摇床上过夜培养。第二天，每一颗克隆取10ul+10ml培养液，加上两个control，然后上摇床培养，直到OD值达到0.8，然后一个control不加IPTG做negative control，另一个和所有克隆一起加0.2M IPTG 做positive control。摇床4-6hrs让其充分。 所有培养液上离心机去除上清，留pellet。所有pellet各加1ml lysis buffer后vortex均匀，超声破碎3min，5s on and 5s off。一万转离心10min，收上清，收pellet。此时的pellet再加入1ml lysis buffer后vortex均匀。准备run gel。 * u( q. D* I/ a1 M  i' S5 Y
上清的上样量：20ul，pellet的上样量：5ul
" k/ y8 g! k8 g6 I; P0 p0 x  l加好loading buffer，95度10min。' H" Z$ g$ q& f# Z
只要你的marker跑好就基本无碍。  G+ w8 C; N+ v; K1 j) @
考马斯亮蓝染色至少20min，脱色20min一次，共换3次后加多些脱色液通宵摇床上浸泡脱到无背景色。' K8 T; g2 X1 Z
有negative control做指标，在你想要的KDa位置上蛋白斑越大表达量越高。如果没有negative control做指标就不好说这个位置的蛋白斑是不是被IPTG, [. X6 a  @* y  H
induce出来的了。
1 N# ]1 y- q; G1 ~* O6 M% c; M如果上清中没有蛋白斑，但是pellet里有就说明超声破碎不够。

Andyhigh

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  h6 V7 h- g/ ]6 U好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

Andyhigh

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- e% Q  Q$ m6 a
& g( [) j- n& Y4 u" K& y- v好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

fengjh100

1 l: y: D+ H5 G0 f6 o; Q5 T& E
) ^: M- q# y* ^+ V: y根据楼主情况，我觉得提取蛋白是关键，提取蛋白有些环节是不能忽视的，能保证在以下四点没有问题，基本上是可以使用的：1是在冰上进行；2是裂解充分；3是变性良好；4是定量准确。跑WB也有很多环节，各个环节都可能导致没有良好的条带出来，建议行点杂交实验摸索下。至于用丽春红 染色 ，个人感觉还是不怎么靠谱。所以建议：重提蛋白（最大可能是蛋白提取的不好）。至于电泳和电转，分子量不大的话可以低点的电压，电泳时用250毫安就应该够了。很多细节可以认为避免的应该注意。祝早日跑WB成功！

Andyhigh

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