最近在做Western Blot（WB）,遇到一些问题，想请教下大家

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子: O$ |$ t: b# n6 m* Z/ k' U) i( m
- C# y6 y' v) V2 E* B8 L% @
好像做原核表达鉴定蛋白不用做内参吧，至少我没听说过，一般来讲做SDS-PAGE鉴定就可以了，严谨的话再做WB

Andyhigh

回复 DNAngle_RNA 的帖子1 K8 O; `/ I. m
, _, r% ~1 Q5 k2 N! z8 h, \# A
哦 ，我就是想用原核系统表达并提取 纯化我的目的蛋白

DNAngle_RNA

回复 Andyhigh 的帖子
) e, P+ N: b. R; k8 E: L* t; F$ W7 g2 {+ p$ a2 X9 F6 J
恩，表达纯化，再做WB鉴定就可以了

cyberpig

GST +ve (positive) 指已知帶GST tag的protein (作western blot外參)。我想表達的東西同時有His和GST tag的。: W% |' I6 J$ E( Z0 `9 m
- G6 f: j9 o* F; ]
BL21和pLysS的分別應該只是有否表達溶菌酶，而我選這兩種是因為我們實驗室最常用這兩種。做IPTG誘導的話，它們的分別不大。但做autoinduction的話，pLysS不能用就是了。如果這兩種都不行，只能試一下rosetta, C41等。/ m9 e3 h0 g8 l" K& j

3 @5 c) R; }! }: G  r. B  j  \

hbs08230

在转入BL21以后需要做一次small scale的测试看看表达量。, n' F  Y$ Z' B9 M; L
在涂了BL21的细菌板上挑5-10颗形状规则的克隆，用培养液摇床上过夜培养。第二天，每一颗克隆取10ul+10ml培养液，加上两个control，然后上摇床培养，直到OD值达到0.8，然后一个control不加IPTG做negative control，另一个和所有克隆一起加0.2M IPTG 做positive control。摇床4-6hrs让其充分。 所有培养液上离心机去除上清，留pellet。所有pellet各加1ml lysis buffer后vortex均匀，超声破碎3min，5s on and 5s off。一万转离心10min，收上清，收pellet。此时的pellet再加入1ml lysis buffer后vortex均匀。准备run gel。 , A# J! h0 c/ m0 Z# ~9 n; x; [
上清的上样量：20ul，pellet的上样量：5ul- R/ Y* W0 X7 T  D
加好loading buffer，95度10min。% p( ?: u. S" [
只要你的marker跑好就基本无碍。
( c' f+ S, d, m考马斯亮蓝染色至少20min，脱色20min一次，共换3次后加多些脱色液通宵摇床上浸泡脱到无背景色。
! D0 C; {- L2 D3 l& P$ P有negative control做指标，在你想要的KDa位置上蛋白斑越大表达量越高。如果没有negative control做指标就不好说这个位置的蛋白斑是不是被IPTG$ x$ }; b8 z  y+ n7 y
induce出来的了。
1 w$ D- ^+ \" A. i# ]如果上清中没有蛋白斑，但是pellet里有就说明超声破碎不够。

Andyhigh

回复 hbs08230 的帖子
! v5 G* B9 n' @$ k4 U' G- J, \1 C# a4 f3 E
好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

Andyhigh

回复 hbs08230 的帖子
0 ?2 c* i& j. c
1 o# O. a4 D& }好的  首先谢谢hbs0230  今天在图书馆写了一天东西，实在是不想仔细看了，明天仔细推敲推敲···  谢谢了

fengjh100

) Q0 q' P2 `$ l" [
. `- h4 e/ b: ]3 ^: L
根据楼主情况，我觉得提取蛋白是关键，提取蛋白有些环节是不能忽视的，能保证在以下四点没有问题，基本上是可以使用的：1是在冰上进行；2是裂解充分；3是变性良好；4是定量准确。跑WB也有很多环节，各个环节都可能导致没有良好的条带出来，建议行点杂交实验摸索下。至于用丽春红 染色 ，个人感觉还是不怎么靠谱。所以建议：重提蛋白（最大可能是蛋白提取的不好）。至于电泳和电转，分子量不大的话可以低点的电压，电泳时用250毫安就应该够了。很多细节可以认为避免的应该注意。祝早日跑WB成功！

Andyhigh

回复 fengjh100 的帖子' U( @/ @( T/ l8 X! X

7 U* x8 W. \6 L. G- [3 ^' e" o1 u