请教关于EB的形成与克隆的挑取

your1024

请教一下各位：
$ e9 a/ R" [7 T1 H1、如果用悬滴法形成EB的话，是使用纯的ES/iPS来进行的么？细胞量大概在多少呢？那MEF是如何消除干净的呢？
3 [/ D- [5 K0 Z9 T$ B0 _+ x+ A2、如果直接用悬浮法的话，就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么？是单细胞悬液么？MEF不需要清除么？
9 `% D+ O) Q; t4 S! w, j3、还有在细胞克隆形成的时候，如果需要把克隆挑取出来，各位是用的什么设备呢？普通的体式显微镜能够看到么？还是需要什么特殊的配件才可以？
# b2 S. D5 z" a4 O/ I8 j, b: v2 M谢谢各位！

zpzp0312

直接消化后不必去除MEF，ES细胞会形成EB，MEF就直接分开了
+ B0 k3 v: t  {如果要取出克隆，直接用10ul 的枪头就可以

frankieisme

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2 L$ ~9 i  q2 }0 I5 i! ]2 z, h1 I$ {
; O% P8 Z: C7 d  T4 _悬滴法形成EB,理论上用纯的ES/iPS.细胞数500-1000个/20ul,MEF通过差速贴壁法去除.具体方法:胰酶把细胞消化成单个细胞,之后用分化培养液重悬细胞,在事先0.1%明胶包被过的小皿中差速培养1h，大部分MEF  细胞已经牢固贴壁，而ES/iPS还没有贴壁，收集上清获得较纯的ES/iPS，计数之后悬滴培养。
7 `/ y2 }1 [) @+ i0 }9 m细胞克隆形成之后用10ul的枪头挑选，可事先在培养皿有克隆的部位划个圈，然后再挑出克隆。

your1024

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6 K4 M, O0 b3 E
感谢回复！

your1024

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回复 frankieisme 的帖子8 Z: b" e+ q/ n: b5 }! I

1 d% K) t! R1 k% W) p8 Z9 x5 w/ @谢谢您的详尽回复！

your1024

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) Z& l& R  P1 B$ @
9 k& D9 |; k% l$ ]想再请教一下，EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么？我总是不能让EB很好的贴壁，要么是看着已经贴了，加液之后又重新悬浮起来；要么是放的时间长了，细胞都死了（本身带GFP的细胞，淬灭了），我用的孔板，事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢？还想问下，如果做WB或者PCR的话，6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢？谢谢！

frankieisme

回复 your1024 的帖子" k8 W6 \" Q  ^% U) a" N

2 w5 w3 @. R* }, ]% d6 C% \$ u0.1%明胶铺半个小时就差不多了。EB有点抱团的习性，尽可能把EB混匀。还有密度尽可能不要太大了，EB太多了不容易贴，容易散开，6孔板一孔种二、三十 个，大多数都能贴并能跳，我的经验。要做WB或PCR的话你只能多准备些板子。 一般第二天换液，不能贴的也就不要了，随后根据细胞状况每天或隔天换液。

your1024

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谢谢！我再实践一下。

waterbubble

我们用悬滴法做EB，hESC 每滴1X10^4个细胞 20ul