DC-CIK细胞的制备方法

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【背景】; }7 @! l6 i' R
        CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。! K& U& i$ J2 |
  - ]* K  O# Z( u7 r& J; O
        DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。2 X+ [2 ?( u" K( \
  
/ c9 \2 J- x/ B8 P/ s6 b         DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。& Q* r# f- V% L. s8 S
  9 K0 g3 U4 F/ C' [
【培养原理】
# U; ]) n3 }! a# j! M# w7 m% f1．DC培养用细胞因子：
% A# h' B* @( K- T" L4 q3 w/ Z( ]4 {) {
•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：
5 N6 B4 L, `# h7 y                GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细
0 R3 L( R( T3 y5 ]+ q3 {! G2 F         胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。* T* Q  U& h! H3 u  x4 h' C6 t9 I
  $ c9 j. y4 G0 ]& M8 _" h1 {
                GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，& m6 I8 b/ c; I  J- x, W& ^
         从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。6 {7 ~6 J3 h/ D
•   IL-4 (白细胞介素-4)" J9 q2 w# R1 a! f# X
                 IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向
6 O$ t6 p3 U0 f4 c         分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能
8 @; N, U5 H7 d+ T" n% B0 C5 F- h         力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。7 x) {) M6 ?( K
  2 i8 T5 G& a7 d7 V( ]9 W4 m- l
                GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取
7 r8 _  K+ g5 T8 m# M         和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不& q( {  v6 N+ ]" U. E
         表达CD14。
+ f% d0 [8 M4 Q5 F9 S7 w8 n•   TNF-a(肿瘤坏死因子-a)
/ k4 t# F5 \* y& m' t' p9 W: O                 TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II     " Q  g) _) E' N' w
          compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟- e4 q- T9 E# j/ i
          DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的7 o) F, {* r# y" {, m8 t4 B+ r. o
          激活T细胞。' A( l6 A, ^, @3 N% s. k# x& T5 {/ F  _
  
2 s0 `" J# ]: o% r& T8 |/ l2．CIK培养用细胞因子和抗体：  •    CD3激发型单抗：3 b6 m& W) X8 h$ m0 i1 w" o( J0 i$ \
                 T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈$ B" b# x6 T% J" k( P; S# b
          的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表
5 e3 W7 c. V& T  \: S6 _. x          面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的  3 O" q2 ~$ J1 c' o- p% E
          辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使) p. f/ ~; R0 h3 q0 X& p
          CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸& l1 ]& C* N, O5 e3 a7 b
          (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇
) a2 t8 c5 c  y# F4 d. k          途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(
) J2 O7 c6 |5 m          如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
: D+ v# e) p# l$ C, G  
' F% U  [2 z) \$ y: P                 由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子
& w( f6 A8 x( C  @' i! [          特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激& x& e3 h) [# ~
          活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，
+ m( B. V! m4 V5 l% O0 _3 n; Y) ?: p         从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
; s( @1 p* w1 h5 c0 t          ) k  U* q9 g/ O  X; O
                 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺1 h- w2 E* q( j5 ~) a' {
           激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养' r" [8 x) f8 E2 {8 h0 O
           时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。* [* @. I  f# f
•   IL-2 (白细胞介素-2)
9 A8 s; C- P# h8 W' ?& Q$ o9 n* F                 IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-+ [: p/ `) ~) G2 ?
           2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞1 z$ y4 Y% O* }' T5 n" G7 a& V, ]
           活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加, [: |1 X3 w" o1 `4 s
           IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
$ \, @" P. C( K& c9 ~; C•   IFN-g(干扰素-g)  Q( z. ^7 B* F7 i1 ?: q/ I
                  IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强' j" U4 z. ^3 O$ q5 g1 _$ t
           度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活; O' u/ _+ E5 L1 D
           性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。) `* i" @) E; W4 A8 g' d" d6 w- N
•   IL-1-a (白细胞介素-1a) 　
  S. h( w" W0 Q5 C% V. i                 IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显
( R: U+ a: j0 b4 [( Y0 N1 c           提高CIK 的细胞毒作用。
' l7 }. c4 e( |, c  
- |$ @' f4 d2 U; V5 X" `0 a( F" }  @【细胞制备】: y' @, h6 t* Y+ X/ n
1． 外周血单个核细胞的采集
4 s$ P) r7 M5 @        1.1      用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；. b" h1 G; s/ x7 n) ~
        1.2      淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
  Z# B& x# D  B% d! x+ u6 ?6 T        1.3      无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。% z) a0 J( k& h" k' W
   + R# c/ w2 t/ L4 a& m6 {3 i, H; X
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备 6 h4 O5 q& |* O: y$ e$ x
                 用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-
( W' d7 r4 ]( \         Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
8 ?* m' z1 w) d* f  
5 f1 d& }. `; P& K0 M, H                 用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，; `. f. }9 v: W: y/ a5 I6 l
         而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而/ k1 b) Z+ g& _- b
         实现对肿瘤细胞的有效杀伤。5 @7 C8 @( e8 f- V4 ]+ K
    7 z& d2 w: H( ?6 n1 o
                 肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或
6 a% u# P2 b7 l+ D         死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞" t+ H  O  r* T, x' m) E5 [
         裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
1 d, p3 R/ f+ g5 a  
  C8 |. b! a7 j                 反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
7 U: j/ f+ D1 H' n          2.1      手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；8 c& H, I6 y( I" f; v( {3 A
          2.2      无菌生理盐水洗3次；
4 X: N7 W; b9 u- ]$ t7 W! \          2.3      用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；3 ~3 b8 |) |5 `2 l3 m
          2.4      200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；# n! n5 C2 U  l6 }5 V
          2.5      用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；# S; H6 ^" C( d: j9 C+ Y
          2.6      将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；6 t& G' \/ c' R( V
                   注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。- y3 o/ D/ S/ o: h& @: ~' X
          2.7      将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；: i' k1 C) l+ _3 \3 ~
          2.8      收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
' l0 {7 E( b7 m          2.9      -80oC保存备用。
. N) t0 r, r) q! g% y, ~3 K
) I6 `& R. s/ ?" ^  f" g 3． CIK细胞的培养及鉴定$ I  r& C& v1 G: `  L
          3.1      步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；" _; Z3 L" t$ @8 |$ I# e6 l
          3.2      37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;
9 k& U' {" w  o6 ^( j, ^* E          3.3      收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
" M) E2 u2 M) ?0 l( L# D8 ^7 Q" Z          3.4      加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；. Q- u! c* U  p1 G4 u) [6 G
          3.5      24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；9 g  \5 P4 L* g, p
                     注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
4 H6 u, o$ ^3 B" U7 R9 |          3.6      每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；8 u: F  E+ g3 C. H% |8 U7 b" x
          3.7      在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。% G9 e7 P$ C. h' P/ w3 ?) D3 g
          3.8      CIK细胞质控：, ^( K! q8 @5 ~, J# R
                   3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
, Q* {/ [/ p& n  U* I( G                   3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明& S, ]0 d5 V  I. N0 l
                              显提高。9 p; m+ i2 I' y4 R& h* x3 o' T
  8 c# }& Q; I5 L/ T
4． DC 细胞的培养及鉴定8 L; }; Y- r8 ?' M+ M; W
           4.1      步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人' m- m2 C4 ]) t) a1 E9 s* T. i, I
                      IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；) I9 C3 O- z! M9 u
           4.2      每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
5 I& ~6 L* p; W$ |. P" D           4.3      (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
/ K8 X6 l0 Q5 z: \3 m1 m3 y. r3 Y                      注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。3 O' M! s) i9 e, x9 c
           4.4      在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；# s5 r3 @& L  v  E5 c, U
           4.5      在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；5 O/ Y' f! q7 g
           4.6      DC的质检：* Z: e* W  t- ^% h% V
                   4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
4 k+ C4 O# l6 b/ b) X$ L                   4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。
* ^  \7 A. k  u+ m2 f& O' C# T& _& \  
* M9 [  r- G! \6 _! c 5.     DC-CIK细胞的制备和质检  h, J9 b2 e2 d$ i- w, \8 T- {
           5.1      收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
, w1 k/ f/ V$ |) N0 k7 L  J9 P4 z                      加重组人IL-2 (300 U/ml)；6 l9 _0 p# t3 R  e
           5.2      每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。$ O9 L1 o7 X- [$ o$ D
           5.3      在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
" \" G- X* n& F3 }7 o- d           5.4      DC-CIK细胞的质检：
1 Z0 f! d5 \( p& H& c9 e* i& E$ |                    5.4.1      台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
: `; H* O& N- l! Q                    5.4.2      流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%) ^3 F4 ~) c; k: i3 P
                                   以上。  Y! j& a; L+ ?, X6 d
                    5.4.3      细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
" a7 p( t( y/ X$ R! v                                   细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 1040 `% q' V# X3 ]. K2 r8 x
                                   个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检* B+ g- i! S$ R2 g' J
                                   测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
! A/ H; W8 ~1 E; y# G+ E                    5.4.4      收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病- @( f( e* A& s+ v! K
                                   原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。' r4 B/ A' R- G6 m( ?, |" A4 S( F

! X0 S9 S7 {$ F6 y' ?版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题） ! H0 c5 W! R, E3 P
  【步骤简图】3 L  l; D2 U4 w' A2 Z7 \8 r

& E- Y8 o( Q/ T2 C

yakunsong

学习了，非常感谢

mmssyyee

很详细。

aidiulgy9517

回复 defu 的帖子( R" d$ c+ L9 [" y: R( M1 A! p

! b1 O- e. z( Z8 B5 _很好，谢谢！ 不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。

Life_Tech

支持，很好的内容。

刘艳85

想问一下，CD3用的是什么厂家啊？谢谢

细胞海洋

回复 aidiulgy9517 的帖子$ V# b% c& S* c! @4 \
2 C, c7 G' f/ }+ }
你好 这个问题我不懂 因是会员发布帖子 尚需大家来共同确认是否存在错误。3 m: p) W& y0 T# I. C6 ^
6 ^! z8 D- P8 M) y) A3 ]8 z) ]
帖内已经红字加注，你能说明一下具体哪里有问题，如何修改？
0 i# J" i7 K  ?
  |9 y$ L. y7 n. Z+ z% D/ y+ `谢谢你的支持

helong

DC的培养方法已经发展变化了，上述方法算是经典方法，但耗钱费力。
- o# g0 J6 E2 p/ t# T" I# ICIK是非特异的方法，DC具有一定的特异性，DC-CIK联合则兼具特异与非特异，实际情况是不伦不类。9 G: Z" Y" M" ]8 [' H
实际应用中，我相信CIK+DC方法优于DC-CIK！

aochongyu

很好的帖子，顶一下

helong

回复 细胞海洋 的帖子0 X9 H) B' i/ y: q* k, Q; f3 S
+ u4 \7 H. L6 y/ N, J# q
看来斑竹也是大外行