脐带组织贴壁要多久传代

willow0711

脐带华氏胶组织贴壁得间充质细胞，培养了14天，想请问各位大侠5 g0 d1 r) D7 V  s
1、爬出的细胞集落密度要多大需要传代？还是每个皿中的细胞密度或形态什么样子时要传代？
) Q) f" P( `( h  F# t9 Z2、10cm的皿要加多少胰酶-EDTA？& y, _8 Z  {6 N3 m' }$ Y- H
3、离心力多少？几分钟最好？8 y0 ~2 _( m, P3 u- y" R
谢谢，希望有经验的大侠指导下！

gejianyun

1. 主要看培养瓶或皿中的细胞贴壁密度，大概80%左右可传。* D/ g. b3 O' U! L) u$ D% H  U
2. 10cm皿我加1-2ml胰酶。
/ e5 _9 M: l' k; t3.  离心没特殊要求。1200-1500rpm， 5-10min差不多了。

get0715

6 U! o. z# x' D4 J& O" ?* Q

0 N* }5 R% O3 k/ ~% R4 P% ^( |1、原代组织贴壁法爬出的细胞大概在12到15天之间传代，多数是13天或14天（培养基不同可能需要培养的天数也不同）。由于细胞爬出不能人为控制，因此每个培养皿甚至不同区域的细胞密度差异都较大，评价是否需要传代主要看单个培养皿中的细胞集落中心区是否已经长满细胞，多个集落需要大多数达到此标准，此时如果论单个皿的细胞密度肯定达不到80%左右，如果能到60%就已经算比较好了。如果按书本上说的达到80%左右，那么细胞集落中心部分就已经大部分脱落或老化。
) E3 ]# _# ~* d, E% e2、10cm的培养皿只加1mL胰酶即可，适当倾斜培养皿将胰酶盖过培养皿的每个角落即可。胰酶可以不加EDTA，加EDTA的胰酶消化的太彻底了，形态不好的细胞也能同时消化下来，可能纯化效率会降低。胰酶浓度根据你自己细胞的情况来定，0.08%通常就可以了，如消化效果不理想就考虑加大浓度0.125%或0.25%。
2 r8 z0 V7 k" z+ j/ \1 `3、离心如一楼老师所说没有特殊要求，1200rpm，5min就可以。离50mL离心管的离心机半径不会相差太多。

iytbxxg

1、原代组织贴壁法从原代分离培养到细胞传代一般12天到14天就可以了，但这个还是会因人而异的，所以从11天到20天都有可能的，我一般是根据自己要传代的比例来选择细胞传代的融合度（密度），如果是按一比二比例进行传代的话，会在细胞融合度达到40%到50%就进行传代。8 x3 ~. }' F! P  w4 p
2、10cm的皿要加2ML胰酶-EDTA就可以了，一般采用0.05%的胰酶，有时也用0.25%的胰酶，我想在这两个浓度之间都可以吧，自己可以适当调整，关键是终止胰酶消化的时间要掌握好，看到有80%左右的细胞脱落就马上终止，0.25%的胰酶消化时间会快一些。- \8 o) q' i4 k- i; H% q9 t
3、离心力一般采用1000rpm，10min。

willow0711

回复 gejianyun 的帖子
- N- S/ P5 G# e$ q/ n+ T; p& x3 [# r3 H9 _$ s% m
哦，谢谢！

willow0711

回复 get0715 的帖子6 {7 j$ Q. J3 r. q  f

/ B) P0 w( |" c+ x( i哦，谢谢！我今天看看，按您说的能否传代

willow0711

回复 iytbxxg 的帖子' Z) |* W7 c1 r7 z( c" S
  P! w! P3 V0 s( m% m+ ~
谢谢！我记下了

deshenglll

回复 willow0711 的帖子. P0 s1 P/ _9 ~1 Q% [# |

) Q9 _# J1 C! H3 {, ]1.这个密度问题主要还是靠你自己的经验，多做几次就知道了，不好形容。
, G! l  g8 y* P8 }( P" ~3 o+ {4 z2.10cm的皿加3ml0.125%的胰酶就行了。
, {' X. t( i  C3.离心力一般在210g左右，收集细胞最好10min。+ o& o  s6 `+ l" e2 I" F

mbpsky

1.脐带组织块密度取决于你剪的接种的组织块大小，越小越碎越容易爬出细胞，当然费得时间会较长，所以期间你要加入少许的培养基剪切，我做的脐带组织培养最早可以5天爬出细胞，视爬出的组织块数量而定，大约3~4天，大多数组织细胞汇合可传代。主要看整体水平连起来即可，不要纠结于部分组织块。原代培养目的是要细胞，而非细胞数量。
6 \3 P4 z: f. Z# \3 D) M- ?0 [2.10cm培养皿加2ml胰酶，覆盖住培养皿底部即可。消化时间大约2min.消化1min时候，可镜下观察，大部分细胞无梭形即可，用手晃动会有部分脱落，及时终止。整个消化过程，越短越好。否则，胰酶对细胞损伤较大。: H, k( ?7 N- B# ^3 [- M
3.离心，一般是200g，10min。我一般不说rpm，毕竟所用离心机不同，没有参考价值。