有哪位知道小鼠MSC向软骨诱导后，冰冻切片步骤？

飘飞的心迹

细胞传到P3代后，开始向软骨诱导。由于是pellet培养，做冰冻切片的话是先用PFA固定，然后用梯度蔗糖溶液脱水吗？有谁做过，能详细指导一下吗，万分感谢。上次做过一次冰冻切片，但是没有找到pellet，是需要用染料标记一下位置吗？

myx142

回复 sun_happone 的帖子9 F' a$ O4 j8 j8 g# b& K6 X

0 J7 r$ |8 z/ G2 _5 ^非常感谢。石蜡包埋我说的步骤有哪些欠缺呢？请问你一般是怎么做的?

sun_happone

回复 myx142 的帖子- g! Z) e# ?4 j( C  A
0 ]) a# `  T) b2 l$ N& p! D9 D& Z
好像石蜡切片的形态会保存好一点，切的片子更薄一点，但缺点是有抗原修复这一步，带荧光的抗体效果没有冰冻好，个人理解哈~~

myx142

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1 l7 m& W$ X& a0 ^$ Q, n, G( l% ~* R+ Y( ^8 p
你好，看到帖子你的留言。想请教你一些问题。希望能帮一下。非常感谢！
2 ]" t: I- S+ r2 D5 ~  n2 f; n关于间充质干细胞软骨pellet诱导，诱导后的pellet怎么做切片。有说冰冻切片的，步骤入下：1、4%多聚甲醛固定24小时。5 V; B2 A- N* C5 q( g+ T9 q% f# r
2、20%蔗糖脱水至沉底。& n0 k: A& \2 a+ e9 ~
3、沉底组织OCT包埋，-20度恒冷箱中切片。
" g- ~% M+ k/ F4 P5 ~请问哪里是欠缺？有说的梯度浓度蔗糖脱水各个浓度分别多久？
) l6 V; R5 ~) f" I6 k还有石蜡包埋切片步骤如下：  x; G: Q$ a/ N9 h
1、福尔马林固定。% T5 f% T5 V# f7 e% |: u2 J, s
2、脱水：50% 乙醇（90min）→70% 乙醇（90min）→85%乙醇(90min) →95%乙醇(90min)→100%乙醇(60min)→100%乙醇(60min)。
2 Y* g" x+ x5 B( s3、透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯 → 二甲苯 → 二甲苯，每步60min。
# h4 l5 E3 n. V4、渗透： 1/2二甲苯＋1/2石蜡(90min)→石蜡I (120min)→石蜡II(120min),62℃。
4 h, x0 F' y! Q  i5 J2 j, n: Y5、包埋：将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。3 b* u# D' k  R' m+ f
6、切片、贴片。6 O  f7 L+ O% V1 d
请问这两种方法效果是否有差别？非常感谢！

myx142

回复 飘飞的心迹 的帖子4 v* g4 M8 M( u2 G! ?; ]2 Y4 S2 m$ w

8 A7 n8 I+ S0 y你好，请问你做冰冻切片的步骤是什么？我查到的如下：8 n% H6 L& u- b! O! X* T% z( M! Q! F
1、4%多聚甲醛固定24小时。
# M8 ~5 Z- P) {2、20%蔗糖脱水至沉底。
0 ?0 i/ k. p' t/ g3、沉底组织OCT包埋，-20度恒冷箱中切片。
- K! o0 W; G) `, c4 ?$ g请问哪里是欠缺？你们说的梯度浓度蔗糖脱水各个浓度分别多久？
# [8 w( E- G6 I; ~% X还有你是否试过石蜡包埋呢？这两种方法效果是否有差别？" z9 x; Q# j, l1 d5 ?/ b( s' A
谢谢！

细胞海洋

回复 myx142 的帖子$ r5 a+ x* z! I7 c% i. @8 B( @7 V

  l" N/ h1 I% q建议你发新帖提问

myx142

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# h8 b# S+ J/ S; O' B! F2 m3 z" ?
你好，请教一下你做pellet培养用的培养管是圆底的吗？什么材质的？在哪家公司买的？我怎么问的试剂公司没有卖的呢。。。

飘飞的心迹

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5 k9 s% j6 v' h1 y" d1 X很感谢！实验是现在做这个不是很成熟，是在摸索中。我们起步较晚，谢谢你的经验。我冰冻切片一般切10vm，或20vm，是不是有些厚了？

sun_happone

先固定，然后用蔗糖梯度脱水，我一般用福尔马林固定，听说PFA对组织渗透性比较强，冰冻切片的切片厚度也很重要，可以向实验室的师兄师姐请教一下的。