有哪位知道小鼠MSC向软骨诱导后，冰冻切片步骤？

飘飞的心迹

细胞传到P3代后，开始向软骨诱导。由于是pellet培养，做冰冻切片的话是先用PFA固定，然后用梯度蔗糖溶液脱水吗？有谁做过，能详细指导一下吗，万分感谢。上次做过一次冰冻切片，但是没有找到pellet，是需要用染料标记一下位置吗？

sun_happone

先固定，然后用蔗糖梯度脱水，我一般用福尔马林固定，听说PFA对组织渗透性比较强，冰冻切片的切片厚度也很重要，可以向实验室的师兄师姐请教一下的。

飘飞的心迹

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% f" Q# y: A! X1 s6 C* l# N
很感谢！实验是现在做这个不是很成熟，是在摸索中。我们起步较晚，谢谢你的经验。我冰冻切片一般切10vm，或20vm，是不是有些厚了？

myx142

回复 飘飞的心迹 的帖子( a, |+ \4 o3 V$ q6 b4 L
7 s; P3 P3 D3 r* V, }, x2 E( W
你好，请教一下你做pellet培养用的培养管是圆底的吗？什么材质的？在哪家公司买的？我怎么问的试剂公司没有卖的呢。。。

细胞海洋

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& [' v; ?% h& p. _建议你发新帖提问

myx142

回复 飘飞的心迹 的帖子/ W: L5 }' |# z) N7 B8 t- t4 X& ~

  A. Q0 g+ M+ x$ `! ^. q9 f1 Z! s你好，请问你做冰冻切片的步骤是什么？我查到的如下：
& X! p; S* H4 N8 C" d1、4%多聚甲醛固定24小时。) l4 {) ~4 ~2 G5 Q
2、20%蔗糖脱水至沉底。1 ~) }7 s4 q5 \1 E+ g) J) d8 Z1 m
3、沉底组织OCT包埋，-20度恒冷箱中切片。
; ]: ~2 \7 Q  n- E6 F( F' |  Z: A请问哪里是欠缺？你们说的梯度浓度蔗糖脱水各个浓度分别多久？7 o) X1 s) H- x
还有你是否试过石蜡包埋呢？这两种方法效果是否有差别？
- q  \6 e2 C7 Z/ K; n. F; m& k谢谢！

myx142

回复 sun_happone 的帖子. L3 ~' o, N9 B3 G: q/ B* h: h) x: r

% m( Y1 M0 [& l  b你好，看到帖子你的留言。想请教你一些问题。希望能帮一下。非常感谢！
: v/ N/ R! J- F  M* K. z关于间充质干细胞软骨pellet诱导，诱导后的pellet怎么做切片。有说冰冻切片的，步骤入下：1、4%多聚甲醛固定24小时。
0 O6 R4 i; k# X2、20%蔗糖脱水至沉底。" Y6 h$ u* A9 a6 m
3、沉底组织OCT包埋，-20度恒冷箱中切片。, N( r7 F% A; y# X6 R
请问哪里是欠缺？有说的梯度浓度蔗糖脱水各个浓度分别多久？9 x+ Q4 d; l) c- G4 s. ]5 d  C1 M
还有石蜡包埋切片步骤如下：: I+ c# K2 q" b" t- p6 _( [
1、福尔马林固定。
4 c+ i( o& B8 z2、脱水：50% 乙醇（90min）→70% 乙醇（90min）→85%乙醇(90min) →95%乙醇(90min)→100%乙醇(60min)→100%乙醇(60min)。
  @! f' n8 D! X! D3、透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯 → 二甲苯 → 二甲苯，每步60min。
/ E) I* P0 ]: ^0 w4、渗透： 1/2二甲苯＋1/2石蜡(90min)→石蜡I (120min)→石蜡II(120min),62℃。( L) o; H7 x$ |* C
5、包埋：将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。
" P, R4 h+ v5 p3 F: S* g2 r6、切片、贴片。
( b0 v* r/ W3 B! V6 x请问这两种方法效果是否有差别？非常感谢！

sun_happone

回复 myx142 的帖子" P+ a& e1 Z; U
$ v3 x' z2 A) {4 X* e
好像石蜡切片的形态会保存好一点，切的片子更薄一点，但缺点是有抗原修复这一步，带荧光的抗体效果没有冰冻好，个人理解哈~~

myx142

回复 sun_happone 的帖子9 T) V+ Z  o0 E" i

) P/ z3 t& b. X- e非常感谢。石蜡包埋我说的步骤有哪些欠缺呢？请问你一般是怎么做的?