表达载体构建-请教-大家都进来给点建议啊

Andyhigh

最近构建了一表达载体，载体图谱如图（pET28a）4 m. R% v$ b7 N; B/ `- d7 o
* F" t; F9 A( T( g5 K% m) e: ]  A8 _
自己在Hind III  和 Xho I  加入了  目的基因CDS区(去除密码子)+九聚精氨酸（9R，一种穿膜肽）    转化进BL21（DE3） 用IPTG 诱导表达, |+ v( l$ f! @! |. m% [
试验目的： 生产出带穿膜肽 和 标签的 目的蛋白，标签的目的是方便纯化# ~) Q( f% K  W1 u4 O
  U; e' g  {7 g6 Z6 J& n  ?( z

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9 h) V8 ?9 X. O, y1 f问题：
( a6 U  h6 C: \1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下
$ |" o) F% D# p/ J3 Z/ |! Q% O2. 自己构建的载体：   在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His  和 一个T7）???   + O1 l1 d8 [- @5 e3 O# D
3.  原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？  还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？ 3 ~. O8 R/ w3 |5 z
4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。0 F7 Z, H4 [# J/ e6 V

  S/ Z8 f8 ~8 U, e1 z) r3 Z自己是新手，望各位高手解答，谢谢了！！！

Andyhigh

图谱

2013-9-2 09:57 上传

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Andyhigh

真心想知道自己构建的载体是否存在问题，纠结当中！！！