表达载体构建-请教-大家都进来给点建议啊

Andyhigh

最近构建了一表达载体，载体图谱如图（pET28a）
  m) n9 ~+ y" |! A% n+ w) T8 G, R0 X) @: J2 Q7 s
自己在Hind III  和 Xho I  加入了  目的基因CDS区(去除密码子)+九聚精氨酸（9R，一种穿膜肽）    转化进BL21（DE3） 用IPTG 诱导表达
# O! x* {' w5 e试验目的： 生产出带穿膜肽 和 标签的 目的蛋白，标签的目的是方便纯化
7 q5 A5 {) B" Q& |
% f3 N% ]" I8 z6 Q  A* X# d+ z/ H+ v0 y7 Z% G" f  X$ a
4 i* v4 |& V7 V  T/ Y: h( h
问题： 8 |  j( u8 ^/ w8 e+ T' ?0 ~
1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下; N. F7 w# Y. k# e% Y0 M
2. 自己构建的载体：   在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His  和 一个T7）???   " W! T* s1 g+ L* J9 X
3.  原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？  还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？
( Z& y- n4 L* Q7 d8 T# _4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。- ^2 v4 G$ }4 T1 _: z

, e) X8 J( v- |+ B8 t3 E) Y3 k自己是新手，望各位高手解答，谢谢了！！！

Andyhigh

图谱

2013-9-2 09:57 上传

下载附件 (123.01 KB)

Andyhigh

真心想知道自己构建的载体是否存在问题，纠结当中！！！

neuralstem

回复 Andyhigh 的帖子
. [) r9 N: i; a0 s3 v3 b" F8 @, i7 M1 H9 ~5 e
看不清你的图。 简单回答一下你的问题吧
5 j4 J( E& Z2 i& N1. 不明白你为什么纠结这个
8 U$ u" I( C* u' E+ q; z* A, T2. 如果HIS和T7在N端，那么从ATG开始表达。如果HIS在T7的前边，那HIS就不表达（因为没有ATG）。 C端的那个HIS是在STOP CODON的前边还是后边？如果前边就表达，后边就不表达。' g" K8 w( l! y# b! ]# W# m2 H
3. 原核的没做过不清楚7 p! K- ]6 ^' O; A
4. 你应该在你需要的蛋白+TAG之后加上一到两个STOP CODON， 比较保险。 否则C端不知道会出来什么怪东西
. J7 _# x4 n& d# |- v$ Z' L& q( c; ]
% e% c/ c1 c% ^  q( h0 w" A

86964109

回复 Andyhigh 的帖子
2 m* b% j9 ~9 U2 ~7 x( a4 e% |9 u0 t
“去除密码子”？你是想说去除了终止子吗，1 {8 M8 a) {% w- m

+ y# q% W- m8 S9 ^8 B) f- K转录是从第一个ATG开始的，Hind III  前的NdeI和NheI都有ATG，因此如果按照你的插入位置，转录是从前面开始的，所以你要注意数清自己的ATG位置，能够通读，不要移码。
/ X- l; R* P5 V8 h  X% d. S# h8 ?/ \$ D
如果不想要目的序列后面的多余蛋白，那就自己加上终止子呗