求助群友。。关于胚胎干细胞的核型分析，染色体纠结了。。

piaopiao

本次实验步骤汇总：选取T12孔培养板其中的3孔细胞量入秋水仙素，终浓度为0.30μg/ml, m2 b( ?$ a" p  ]- l6 a) {
培养时间约为4h。
* z: D: I- }8 E" h) T- jEDTA消化，吹下细胞约2ml，将细胞及溶液转移至15ml离心管，1100r/min 9min
, R* [( a+ y+ b3 d加入已预温至37℃的0.075mol/L的KCl加柠檬酸钠低渗溶液10ml，充分混匀，置于37℃水浴锅约13min，中间时间段再用滴管轻轻吹散。
( d2 N' F/ o- `# r. ~' F: o低渗完毕后，加入新鲜配置的固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）1-2ml，轻轻混匀，进行预固定。（时间约为3min）
$ Z9 g9 w7 }4 N/ o1000rpm离心10min，弃上清，加入固定液10ml，轻轻吹打混匀，固定30min。
1 j/ J% \/ N( [3 ]' V1000rpm离心10min，弃上清，加入固定液10ml，轻轻吹打混匀 20min: G7 p* W+ K6 ^, `% }) G
1500rpm离心，10min，弃上清。加入固定液2-3滴，约为0.2ml，轻轻吹打混匀成细胞悬液，滴片：将细胞悬液滴在冰水浸润洁净的载玻片（多聚赖氨酸 免疫组化防脱粘附载玻片），长纤维纸迅速搽一下，50cm~60cm滴片，吹开，让液珠在载玻片上走一遍，空气晾干，3天前配（为原液）吉姆萨染色时间为10min，3min自来水冲洗，用吸水纸吸取表面大液珠，电吹风吹干，于200倍，400倍，1000倍油镜下镜检。( L" o$ A3 A9 F& e3 {

piaopiao

piaopiao

图也不知道怎么传。。简单描述下，液滴旁边有很多染色的碎片，然后游离的单个细胞，染色体分不开，而且，都看不出染色体的样子都，不知道哪里出错了。。单个游离的细胞我是2滴一个载玻片，约在30个左右，包括不合格的，观察到的染色体还是粉红的。。。还希望指教。

细胞海洋

回复 piaopiao 的帖子4 m( [) D3 J" q( _8 |7 l
5 q  ?% q8 C9 s
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laner

回复 piaopiao 的帖子3 i4 r9 ]. S( J( X$ ], ?, ]* C
* B, Y4 n! w$ e
低渗不足，染色体分不开

Emma1986

低渗那一步没做好，细胞膜没破，染色体出不来。低渗做好了之后，接着还要摸索秋水仙素的处理，祝你完成漂亮的片子。

luyue6453

回复 piaopiao 的帖子/ [' `  B8 }3 U; ~

1 g& q' S5 b) u你加低渗液时，边加边搅拌，水浴20min。底片的时候倾斜45度角。离20cm距离感觉液体是摔上去的，自然分开，这样细胞才能分开，滴完以后，马上再火焰上烤一下，等液体都干了再染色，原液吉姆萨用pbs稀释，1:9。

iseeyou1210

lz低渗液时间太短。我一般是室温20min，其他的什么37度，什么45度角滴片，20cm摔片都是次要的。