有关精原干细胞培养的小问题

jilele

某不才，刚刚接手GS细胞（雄性小鼠）的培养，很多细节不甚明了，特发帖求助，望各位坛友不吝赐教，一起讨论。% W! `/ u- J) E5 j2 i, H
1）GS Medium 昂贵，但GS细胞增殖缓慢，克隆形态在六天内增长明显，但计数后发现其实细胞总数只增长了1/4，这个速度是否正常
1 g* b( J; q2 a! S4 _- d4 i" B  }2）文献特别指出GS细胞需要较低的饲养层密度（笔者用的是MEF，ICR品系），但实际操作上看GS细胞在低密度Feeder上增值缓慢，而且培养孔局部出现密集的圆形颗粒，具有折光性，疑为凋亡的GS细胞。GS细胞对饲养层密度以及状态要求是否严苛？7 C2 E/ R) R5 l
3）Feeder大批量用丝裂霉素C处理后能否冻存，备用，这个问题我查了很久，有支持也有反对的，反对意见主要来自师兄师姐，因为实践发现复苏后Feeder能损失一半，且状态不好，所以坚持随用随处理新MEF: S7 c+ l( g( J7 I
4）用0.05% Trypsine-EDTA处理共培养物1Min就发现Feeder连带克隆整体漂起，呈白膜状，吹打后仍有丝状体，无法吹散也离不下来，但内含大量细胞，因为Feeder在铺板前用Gelatine包被培养板，且培养液为无血清体系，怀疑饲养层状态差。8 V) u  n: l; D
以上问题因初学SSC培养，所以不甚了解，欢迎大家指教

细胞海洋

回复 sunny218 的帖子& W$ j( j& T, m+ J- c
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看4楼

gemstone

其实Thy1阳性细胞在刚开始的几代培养中是可以检测的。如果建系以后就很难检测到了。我有同感。0 k$ |. G8 g) N7 s: n. d8 q
MEF每次都坐会比较麻烦，可以一次处理，冷冻以后使用，方便。
+ M8 I, O$ F3 j2 K0 @6 [5 ^: b8 O' E' i+ z0 h0 W. Q6 ?
to sunny，有很多文章报道，最主要的是GDNF，bFGF，EGF， SCF等细胞因子。第一个非常重要。

sunny218

看了楼上的同仁们应该都是 很有经验的啊！！我才开始做SSC，现在想问问大家是用什么方法分离纯化的，还有用的是什么培养基呢？需要添加那些东西呢？跪求详细的步骤啊！！

jilele

回复 gemstone 的帖子
' o: {4 g8 T0 i: E0 d/ @% N: o* x
4 d9 b+ Y$ Z8 r9 d( r. J2 a: _7 p感谢版主，受益匪浅. o3 C& F/ g3 v2 L: w+ u4 S
关于第二条，我指的圆形折光颗粒比正常GS细胞还要小上一半，后续培养没有见它增殖或变大，而且与基底贴附略紧，PBS都洗不下来，索性就直接跟GS克隆一起冻存了
* B( G! F/ H0 f( d8 k/ i: V第三条，我解冻复苏的Feeder活细胞数目随冻存时间的延长越来越少了，起初160w细胞铺一个12-well板，现在240W都铺不满了，以后决定还是 现做现用% `# c( [- l0 K3 ]
第四条版主说的很对，因为GS克隆很好消化，1Min左右就分散开了，克隆就飘飘忽忽的，脱离了Feeder,但MEF还未彻底消化，如果此时中和，就会出现丝状卷曲物。我以前都是消化2min就中和了的。! r, q! _" E7 p5 ?1 r4 J

2 Y' ?" q/ C2 e: U4 H" R不知版主有没有染过建系的GS细胞的CD90（Thy）抗体，我用的直标抗体（FITC），结果是阴性的，有点诧异··
, g+ B2 W9 ?# J) v

gemstone

1. 速度是正常的。
* Z) X& x6 M& C2. 如果圆形克隆在增值，应该不是调往细胞。可以通过半乳糖苷酶染色鉴定是否是凋亡细胞。8 M+ Q' r9 b5 c; Z' f% w4 s
3. 处理后的MEF可以冻存。最好是液氮冻存。计算好密度，解冻的时候会有部分细胞死亡。
) e6 o# @: l. v3 d# z4 h/ Y4. 理论上消化时间要长一点，刚刚漂起就中和消化，对于分散ssc并不是好事情。尝试3-5分钟后吹打，中和。