有关精原干细胞培养的小问题

jilele

某不才，刚刚接手GS细胞（雄性小鼠）的培养，很多细节不甚明了，特发帖求助，望各位坛友不吝赐教，一起讨论。
& P0 {4 H: {; }3 p$ [1）GS Medium 昂贵，但GS细胞增殖缓慢，克隆形态在六天内增长明显，但计数后发现其实细胞总数只增长了1/4，这个速度是否正常
+ I5 D- A5 T4 f5 V! F2）文献特别指出GS细胞需要较低的饲养层密度（笔者用的是MEF，ICR品系），但实际操作上看GS细胞在低密度Feeder上增值缓慢，而且培养孔局部出现密集的圆形颗粒，具有折光性，疑为凋亡的GS细胞。GS细胞对饲养层密度以及状态要求是否严苛？
/ V: |7 p& b& o" P3）Feeder大批量用丝裂霉素C处理后能否冻存，备用，这个问题我查了很久，有支持也有反对的，反对意见主要来自师兄师姐，因为实践发现复苏后Feeder能损失一半，且状态不好，所以坚持随用随处理新MEF
+ Q  A& T( u% ~7 `# p. g4）用0.05% Trypsine-EDTA处理共培养物1Min就发现Feeder连带克隆整体漂起，呈白膜状，吹打后仍有丝状体，无法吹散也离不下来，但内含大量细胞，因为Feeder在铺板前用Gelatine包被培养板，且培养液为无血清体系，怀疑饲养层状态差。
! _8 h. X5 i( y) W  m5 s/ a- {; W以上问题因初学SSC培养，所以不甚了解，欢迎大家指教

gemstone

1. 速度是正常的。: V8 `; _% E2 m5 J
2. 如果圆形克隆在增值，应该不是调往细胞。可以通过半乳糖苷酶染色鉴定是否是凋亡细胞。" E7 g2 V! ~( f$ Y' m
3. 处理后的MEF可以冻存。最好是液氮冻存。计算好密度，解冻的时候会有部分细胞死亡。
8 S) \# F( j: m! ~  `7 s4. 理论上消化时间要长一点，刚刚漂起就中和消化，对于分散ssc并不是好事情。尝试3-5分钟后吹打，中和。

jilele

回复 gemstone 的帖子$ {1 y2 h1 [  z! u6 B3 I! x

% e( S9 b( S  ?6 h: J6 c感谢版主，受益匪浅; Q2 [* X9 `# w: k
关于第二条，我指的圆形折光颗粒比正常GS细胞还要小上一半，后续培养没有见它增殖或变大，而且与基底贴附略紧，PBS都洗不下来，索性就直接跟GS克隆一起冻存了% J7 t: N  N  W  B# Q3 T
第三条，我解冻复苏的Feeder活细胞数目随冻存时间的延长越来越少了，起初160w细胞铺一个12-well板，现在240W都铺不满了，以后决定还是 现做现用
( I9 E, k7 g* ^1 S8 ?第四条版主说的很对，因为GS克隆很好消化，1Min左右就分散开了，克隆就飘飘忽忽的，脱离了Feeder,但MEF还未彻底消化，如果此时中和，就会出现丝状卷曲物。我以前都是消化2min就中和了的。
6 K  p, w. T/ D$ B9 d2 Q+ X; J# ]: n! v3 C
不知版主有没有染过建系的GS细胞的CD90（Thy）抗体，我用的直标抗体（FITC），结果是阴性的，有点诧异··& T/ e6 y& I+ J

sunny218

看了楼上的同仁们应该都是 很有经验的啊！！我才开始做SSC，现在想问问大家是用什么方法分离纯化的，还有用的是什么培养基呢？需要添加那些东西呢？跪求详细的步骤啊！！

gemstone

其实Thy1阳性细胞在刚开始的几代培养中是可以检测的。如果建系以后就很难检测到了。我有同感。) p6 _4 U( j. A! H! M
MEF每次都坐会比较麻烦，可以一次处理，冷冻以后使用，方便。, Z& ~0 n* j) [( b
3 {. j( ~2 W* X0 I
to sunny，有很多文章报道，最主要的是GDNF，bFGF，EGF， SCF等细胞因子。第一个非常重要。

细胞海洋

回复 sunny218 的帖子8 ], E$ F# v! J+ p, v9 ?
6 L1 f$ s. \+ o2 k$ c$ e
看4楼