有关精原干细胞培养的小问题

jilele

某不才，刚刚接手GS细胞（雄性小鼠）的培养，很多细节不甚明了，特发帖求助，望各位坛友不吝赐教，一起讨论。9 e0 V8 v! Y6 T
1）GS Medium 昂贵，但GS细胞增殖缓慢，克隆形态在六天内增长明显，但计数后发现其实细胞总数只增长了1/4，这个速度是否正常" U+ Q- |5 Q7 Y' [
2）文献特别指出GS细胞需要较低的饲养层密度（笔者用的是MEF，ICR品系），但实际操作上看GS细胞在低密度Feeder上增值缓慢，而且培养孔局部出现密集的圆形颗粒，具有折光性，疑为凋亡的GS细胞。GS细胞对饲养层密度以及状态要求是否严苛？
( B4 {5 X1 A2 Z0 G7 Q3）Feeder大批量用丝裂霉素C处理后能否冻存，备用，这个问题我查了很久，有支持也有反对的，反对意见主要来自师兄师姐，因为实践发现复苏后Feeder能损失一半，且状态不好，所以坚持随用随处理新MEF
) i1 q# n! Q9 P4）用0.05% Trypsine-EDTA处理共培养物1Min就发现Feeder连带克隆整体漂起，呈白膜状，吹打后仍有丝状体，无法吹散也离不下来，但内含大量细胞，因为Feeder在铺板前用Gelatine包被培养板，且培养液为无血清体系，怀疑饲养层状态差。
* t+ G0 Y. u9 L6 |  g7 t" C! K0 v1 s以上问题因初学SSC培养，所以不甚了解，欢迎大家指教

jilele

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感谢版主，受益匪浅
* Y% ^: a$ n$ E) d. ?" K7 o$ I关于第二条，我指的圆形折光颗粒比正常GS细胞还要小上一半，后续培养没有见它增殖或变大，而且与基底贴附略紧，PBS都洗不下来，索性就直接跟GS克隆一起冻存了
$ ^+ @7 b- g& p2 f5 J- V0 ?第三条，我解冻复苏的Feeder活细胞数目随冻存时间的延长越来越少了，起初160w细胞铺一个12-well板，现在240W都铺不满了，以后决定还是 现做现用
% o  {6 [4 ~3 G" s第四条版主说的很对，因为GS克隆很好消化，1Min左右就分散开了，克隆就飘飘忽忽的，脱离了Feeder,但MEF还未彻底消化，如果此时中和，就会出现丝状卷曲物。我以前都是消化2min就中和了的。; x7 A4 B) o2 \2 f- b
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不知版主有没有染过建系的GS细胞的CD90（Thy）抗体，我用的直标抗体（FITC），结果是阴性的，有点诧异··
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