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你这个现象显然不正常。9 K6 u9 k& a! C$ Y- b; Z
分享一下我们实验室采用的protocol:
* T+ k) W. ]$ A3 q; P# W通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。
7 F9 k$ ~0 r3 c% M1. 心肌分化前细胞培养的准备% o! w/ ^' a; S8 p F/ [2 I, ]
（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。
# Y6 k$ w8 j% ]; _6 S( e（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
& m+ M- d" A- T3 L6 q2. 心肌分化第0天
, q* ]: L o* ?) U( e9 m) \（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。
% [5 w6 u ]/ T1 t* j/ t+ x（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。3 f; @& M% h* c1 I1 Z3 Q
（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。
! d3 ~# r0 T& |+ ?3 p（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。1 w' k8 \' @/ W, W! U m
3. 心肌分化第1-3天6 D' k; m/ h" L1 K3 u
（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。3 u- D; {0 t4 S8 [- s
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。& z8 O2 `+ i9 }1 N
（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。 _) l3 n4 T0 `8 u
（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。; X; @4 i, A' O+ w9 Z5 J
（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。$ k T$ r" V& U: p+ i' H4 I1 t- M
（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。
$ I' ~4 `1 v9 P7 C( W! r（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。& T ?4 m" W8 ]# }' ~% \
（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。
0 h$ Y3 j d) m9 A U$ }- f4. 心肌分化第4天
: v" @+ B, z8 L7 g% M8 ^5 V（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。. L, a2 E1 P$ |( }$ s
（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。* g% e# `! E! K6 q3 S9 ^" L( q
（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔
, }1 z! W. j1 z: k; z J5.心肌分化第5天- V4 n; W7 o: Y, Q# u) g: p% }6 R; H
每个培养孔加入1ml EB20培基。3 N& D! c. V' {# M/ R! t' l0 T
6.心肌分化第6天6 o: x/ [' Z% F, j' y9 C$ k
吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。- ^) i, j- Q$ {' u, M
7. 维持培养3 e7 [, w: @% c5 ~# r* F) T. {9 M
EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。
$ J$ @6 |6 @2 R2 O* O8 h. ]( \9 i0 _+ m# _0 N" F2 W* a
培养基配方：
3 E' }/ U% N8 u# n" _! s$ F" `1. EB20分化培养基/ F( \- S; V+ X/ M. h0 U9 D/ H( ^' J
DMEM/F12 392.5ml
" Y8 |* E2 p9 f- a5 tFBS 100ml+ s: g# I% c$ _4 F
200mM L-谷氨酰胺 2.5ml
3 Z$ w% _7 z+ A( l1 iβ-巯基乙醇 3.5μl
2 b- }' p. O) u! E4 y$ O0 i非必须氨基酸 5ml ^3 o7 B4 c {2 g
/ u7 D1 ^& l; t/ w2. EB2培养基（500ml）
) ` O8 f; k. e: cDMEM/F12 482.5ml1 |: G( p4 |- c% k) d
FBS 10ml& R6 ` W D4 b; |/ D
200mM L-谷氨酰胺 2.5ml( Q) E5 `. |- i( Y
β-巯基乙醇 3.5μl7 i' O) @4 a8 n3 y! }
非必须氨基酸 5ml9 Q% |8 X- s' Q) E4 w
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发表于 2014-3-28 17:47
发表于 2014-4-1 07:38
