胚胎干细胞向心肌细胞方向诱导问题

智露

EB悬浮时第一天是圆圆的，第二天边缘就分化了，为什么啊？这是正常的吗？

Jonathan

分化不正是你需要的么

智露

不是啊，我以前悬浮5天都是圆的，现在边缘有点分化，是什么原因呢？

redmaple

你的胚胎干培养多少代了？

细胞海洋

回复 智露 的帖子2 i% s* R! }! g' v5 G9 U0 i* Z

! l) v8 k( L  N- L- P! p0 Z1 ]: f, {) z( a2 ^& d$ V. V' z
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样. H& b8 r. r2 Y" F" b

, }! s) g9 q/ v3 |, \+ `否则他会看不到

Musing

你这个现象显然不正常。* J4 G$ @! `  S5 o$ z& _4 J
分享一下我们实验室采用的protocol:9 k+ w) u+ P0 P( \; |* B
通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。
7 @) U/ ]4 Y/ ^/ L1 s- ?; N1. 心肌分化前细胞培养的准备: c2 j$ G! T/ p
（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。
; u) l" R' H" R# a" m, L4 ^& [（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
" E: J4 U! L* Q2 F/ z: R2. 心肌分化第0天
' a8 c! M& h! ~2 O. L2 W（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。
' x( n: ~( E6 ^4 ]0 M（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。' M& M7 q; o& j$ ]6 |, a1 Q
（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。
1 `) s5 \) G! {1 a" N（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。8 M* C0 T" P' n* [
3. 心肌分化第1-3天! d4 y  c0 L$ u. d
（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。/ X# o+ B% N. S/ I
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。
  D+ `' ~' ]$ ?; ^! Z+ Q' t（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。
5 A7 `0 E( _9 u1 c& u（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。  k! r9 |( N; e5 u% v5 J
（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。
! y1 i# }. b1 n1 V& D, p$ Z1 s（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。+ U# J3 A& N$ X
（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。
7 h  W0 o/ ?" a/ f( H* d  M7 M（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。
* w: y& ^; F0 x4 D; s# X4. 心肌分化第4天% X/ v6 F7 _( u# d3 S
（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。5 S  I5 x+ ^. z( X3 }" x2 _# ~; O
（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。
1 P, J% [$ x- |1 Z; D（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔' y& e; ]" y0 T. Q3 P% o6 q( S. z
5.心肌分化第5天
6 v* a' J  l- `    每个培养孔加入1ml EB20培基。; y( T6 k0 D( ~' P  t' f
6.心肌分化第6天7 T; _; B$ \' z+ I) L/ G4 h
    吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。. x& h' G8 F8 k
7. 维持培养6 Q% L+ m& z; p5 u
   EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。- w; m' F9 [  y* I% e& A

6 C# d7 b. {: V# I4 [培养基配方：% [1 n5 b9 ^- s0 q% C$ _
1.  EB20分化培养基+ ?- R' f, m/ A( }5 F& w
DMEM/F12                       392.5ml
6 w. _3 Y# H/ x# E6 ]9 s; GFBS                               100ml
! Y" f" t$ E& j  E8 T# ^; V2 m* f200mM L-谷氨酰胺                  2.5ml5 u4 N7 t7 e, w* J! _9 f
β-巯基乙醇                          3.5μl
+ b- f+ u# ]  l5 Q9 G9 N1 [非必须氨基酸                         5ml
6 O" ?, l% M. i0 H
, V4 E. k8 H5 B3 ]8 |6 I2.  EB2培养基（500ml）
# F/ c3 O6 e% I- N, nDMEM/F12                       482.5ml
  D5 {2 F) W- m/ T9 f+ NFBS                                10ml7 G6 _1 I1 S) c  Z7 b" ?) n$ o$ M2 _' m
200mM L-谷氨酰胺                  2.5ml: \% U5 H6 S# }# e. c/ e1 z- m
β-巯基乙醇                          3.5μl
* M1 M: \. T" L" a+ d非必须氨基酸                         5ml0 E% U% H4 ]" e$ [, Q4 s1 o

Jonathan

回复 Musing 的帖子& p! X8 h, j. k% ^' U. P9 M6 J3 K1 z
) z8 f! t2 P  C# B
想问问你这个protocol效率如何？

Musing

回复 Jonathan 的帖子3 G! B4 ~0 V' i! i& R: l
7 D! |0 M# @4 B2 }' C
按照这个protocol很容易做出来，不过效率确实不如人意比较低，目前我们也再尝试着改进~

Musing

回复 Jonathan 的帖子( B- y0 @) |6 [

; s: C1 R: M9 }# m1 l/ {不知道您有没有好的建议  供我们参考的

Jonathan

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) u+ M. H3 O$ c
% h& C" C; P% g& c( ?2 U* M2 B7 B哦。我只是比较好奇效率而已。我前几天发的一个paper是做心肌分化的，你可以看看。我觉得效率还不错