求hES的复苏、冻存和传代方法（详解）

mecol

我是新手，准备养H9，最近也在学这方面的技术，在这里还请各位专家分享一下养H9的经验，最好详细一些，谢谢！

细胞海洋

寻关于th9细胞的早期文献
; S" N9 H8 J6 y4 ]0 y# Ihttp://www.stemcell8.cn/thread-17340-1-1.html' M; r" n6 Y- ]5 j- ?6 A

mecol

回复 细胞海洋 的帖子) Q" M, H% B) n/ y7 a

" `! d0 Q! ?: a5 Y0 K这个完全不相关吧，我要的是人胚胎干细胞（H9 line），不过谢谢啊

shaozi402

看过一些文献，H9和H1的培养、冻存及分化等方面很相似的

mecol

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$ F$ @5 K9 ]% Z; z
求详解啊，我还在学习中，谢谢

shaozi402

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( x7 [! w4 l, A6 k' `' n: S3 C8 e) i/ b  o  `- W4 f
这里是H1的培养方法，恢复帖子不知道怎么上传文件，这是题目：Production and transplantation of retinal cells from human and mouse embryonic stem cells

细胞海洋

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7 R! N: ~4 m. B2 {( F2 Y' N( s6 H8 M9 W' Z% k  a
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青云之上

& p: L5 U% G) [/ m

mecol

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+ X$ L: s+ c/ P$ i1 B# _9 C4 ]# ^0 c9 q
谢谢啊

MZzhang

hESCs解冻; H2 i: E* u' {
从4℃拿出解冻细胞用的培养液，5mL加入到10mL离心管中。
7 b$ f2 G8 y1 N2 D( c0 _1 a2 M在Matrigel培养板做好标记。2 ^5 E! I: b4 f; ^, G' h, a
从液氮罐中拿出需要解冻的细胞，拧紧冻存管盖。将冻存管放入37℃水浴锅中，待冻存管中冰块完全溶解。擦干管壁、管盖上的水。冻存管拿入工作台中。, ^$ s7 o) v; B, w* w
吸去Matrigel培养板中上清，加入hESCs培养液。(12孔板预先加入500μL)
& W; o( v# b7 L& x' D用剪口枪头将冻存管中的细胞，移入10mL离心管中，轻轻吹打、混匀。1 Z) h; Q1 s9 R4 k6 Z- k2 {* ]
1000rpm离心5min。! o' M2 ^! d9 F. x5 }$ S* Z+ n
离心后，稍稍倾斜10mL离心管，用剪口黄枪头贴管壁，吸去上清。& Y# Z; a- _2 Z" p
向10mL离心管中加入1mL hESCs培养液(剪口枪头)，轻轻重悬，1mL分装2孔(每孔500μL)，最终每孔1mL培养液。
3 z& O) t/ u# x2 W' m镜下观察，摇晃培养板，混匀细胞。/ L% S. [: V- z, L
37℃培养。
, A7 i, \2 I' c2 z9 qhESCs 6-10h贴壁。8 |  ~8 `& m2 H6 ~9 H
, d+ _/ Y' k6 S. v. K0 m9 z  K* W  [9 V& F
hESCs冻存- J/ K. A6 o0 r9 Y" ^: n8 \
hESCs吸去mTeSR培养液，加入dispase消化5-7min(一般hESCs传代为5min)；! j- o# w; _. V& V
消化后吸去dispase，用DM/F12洗2-3次；. A1 s  J% e6 ~$ `" a; d& h8 i5 T' X
再加入DM/F12，用剪口枪头刮细胞(朝一个方向，枪头内有培养液，边刮边打出培养液，以防细胞干燥)，重复1-2次(尽量完全收集细胞)；
  N. P5 `# ~% h1 I9 f7 f1000rpm离心5min，弃上清。
) {% J: c* I/ j2 O+ K& `  |加入FMox重悬细胞(12孔板每孔500μL FMox，每支冻存管加500μLFMox )。
0 y5 C* g1 A8 F& X1 _. J冻存管： 细胞类型、代次
7 e9 j) W7 r6 ^7 H" f         培养基
5 M' T; ?+ F3 }         转入或干扰基因( L8 K/ r7 l' c8 `- T3 d, |: T9 i
         冻存时间、冻存人3 D5 S" h% G" x" c4 X3 [
, \" v2 N! U' n8 X
hESCs传代
# I% h" q$ T# V' T- f1 G: o8 @1.dispase 克隆传代
) B( H( ?; X2 f. H6 V  E6 t# `; q剪口枪头吸去培养液，加入dispase酶，消化5-7min(消化5min后观察，克隆边缘出现卷起，小黑圈)，加入DM/F12培养液洗3次(对角线两点轻轻吹洗细胞)，加入mTeSR medium，剪口枪头朝一个方向刮细胞，1传3-4细胞。
, d& W, l1 s# S# Y3 P. P2.accutase 单细胞传代" z! K/ h  W9 i, g: V
剪口枪头吸去培养液，再加入accutase酶，消化1-2min(消化1min观察，克隆中细胞变亮，悬起)，将上述悬液加入有5mL DM/F12的离心管，1000rpm离心5min，离心后弃上清，加入Y27632(1:1000) mTeSR medium重悬。细胞计数，接种细胞5000 cells/孔(6孔板)。( i- H7 K  V2 X