求hES的复苏、冻存和传代方法（详解）

mecol

我是新手，准备养H9，最近也在学这方面的技术，在这里还请各位专家分享一下养H9的经验，最好详细一些，谢谢！

细胞海洋

寻关于th9细胞的早期文献' Z, ^* t1 i. E  X1 |# ?9 I
http://www.stemcell8.cn/thread-17340-1-1.html, H9 o( E' h/ _

mecol

回复 细胞海洋 的帖子8 Q$ d6 y3 o" |- t# a0 c# l
0 [# D, c& c& Q1 n
这个完全不相关吧，我要的是人胚胎干细胞（H9 line），不过谢谢啊

shaozi402

看过一些文献，H9和H1的培养、冻存及分化等方面很相似的

mecol

回复 shaozi402 的帖子9 {7 k8 A" f3 c3 P. i
9 d! p7 L+ [. a4 C
求详解啊，我还在学习中，谢谢

shaozi402

回复 mecol 的帖子  b9 A, l/ e% e$ f
$ `+ R: j. h6 Z$ B0 @! k
这里是H1的培养方法，恢复帖子不知道怎么上传文件，这是题目：Production and transplantation of retinal cells from human and mouse embryonic stem cells

细胞海洋

回复 shaozi402 的帖子8 D+ d7 ]5 U) V  F
! T7 c+ D$ _. M) p$ D; l  @
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青云之上

  h3 a, x: t5 N4 |3 U

mecol

回复 shaozi402 的帖子& c( z5 k2 u! t& d# [0 [
  r9 n# {0 x8 t+ p7 D+ J% h% Z* B
谢谢啊

MZzhang

hESCs解冻
( Y9 ], E  y% |' ]! M( ]从4℃拿出解冻细胞用的培养液，5mL加入到10mL离心管中。4 V3 M- q5 q7 K
在Matrigel培养板做好标记。! e8 `1 d- {  u3 c
从液氮罐中拿出需要解冻的细胞，拧紧冻存管盖。将冻存管放入37℃水浴锅中，待冻存管中冰块完全溶解。擦干管壁、管盖上的水。冻存管拿入工作台中。
" K! @! Y7 F5 d3 G* H5 i. U! I吸去Matrigel培养板中上清，加入hESCs培养液。(12孔板预先加入500μL)
4 k# f% _  K- R1 G用剪口枪头将冻存管中的细胞，移入10mL离心管中，轻轻吹打、混匀。
- P) ^8 W5 O$ K. h+ I/ _1000rpm离心5min。
' O, p! I7 L0 q2 w! |* V+ Z离心后，稍稍倾斜10mL离心管，用剪口黄枪头贴管壁，吸去上清。
. m% g- a1 k7 M8 ?, I; v; e向10mL离心管中加入1mL hESCs培养液(剪口枪头)，轻轻重悬，1mL分装2孔(每孔500μL)，最终每孔1mL培养液。" ?* j  Y/ q$ D2 j) Y3 M
镜下观察，摇晃培养板，混匀细胞。
# R$ ~4 ^* J! h! H! I5 o37℃培养。) B! t- ]1 P( R1 m8 u
hESCs 6-10h贴壁。6 d" j2 Z0 J  E# v5 C

- a0 S9 {6 @0 v9 lhESCs冻存% D/ d6 \7 V" T' x! `9 y
hESCs吸去mTeSR培养液，加入dispase消化5-7min(一般hESCs传代为5min)；$ |6 u  B. ]6 s) o- V% Q4 y
消化后吸去dispase，用DM/F12洗2-3次；: i# N# k6 k+ d; `  r. \9 A/ C- u
再加入DM/F12，用剪口枪头刮细胞(朝一个方向，枪头内有培养液，边刮边打出培养液，以防细胞干燥)，重复1-2次(尽量完全收集细胞)；7 M7 ]& D1 h8 a0 Q: ~: J/ L
1000rpm离心5min，弃上清。' z+ e8 Y) Z) a' A
加入FMox重悬细胞(12孔板每孔500μL FMox，每支冻存管加500μLFMox )。
" L& Q- {& I7 `  X( q# U冻存管： 细胞类型、代次
! f/ B" i; G( q  E6 O         培养基/ Q. P1 ]; I! O5 M1 u# g! j
         转入或干扰基因  z4 Z- J& m- `5 e
         冻存时间、冻存人! `2 O3 U$ ^4 d0 S7 C: h" f

/ N) m, M% T8 ~, e8 |, t1 DhESCs传代
" n2 \2 l: [% r2 d$ I6 L* j8 V1.dispase 克隆传代
7 v% V- E0 M& s: k剪口枪头吸去培养液，加入dispase酶，消化5-7min(消化5min后观察，克隆边缘出现卷起，小黑圈)，加入DM/F12培养液洗3次(对角线两点轻轻吹洗细胞)，加入mTeSR medium，剪口枪头朝一个方向刮细胞，1传3-4细胞。
# u! i3 Y) q( P% a3 y2.accutase 单细胞传代( R/ |) e- t! {' x  h3 H# i1 d+ c
剪口枪头吸去培养液，再加入accutase酶，消化1-2min(消化1min观察，克隆中细胞变亮，悬起)，将上述悬液加入有5mL DM/F12的离心管，1000rpm离心5min，离心后弃上清，加入Y27632(1:1000) mTeSR medium重悬。细胞计数，接种细胞5000 cells/孔(6孔板)。
: d5 w% C7 g- m4 K* Q2 _1 t. [2 _