求助：MSC成骨成脂分化染色问题

龟酱

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, Y( M. `  T$ h8 [成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。
% z& }7 U! D4 n3 j- Z) z用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基+ K7 ^. e# e5 ~* |
成脂：
3 G7 c6 u  q( ?% L9 a+ v' o5 g! {0 R0 G成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象
% h3 W) b' J8 b0 d% @3 ]1 }# h+ L5 t$ l染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤
5 g; N+ ]) e0 q* `$ r1 A染色步骤：
7 c" J! t4 a# Q/ p  c/ x# M 1. 弃去培养基，用PBS清洗$ u" j" y5 l8 q9 i
2. 4%多聚甲醛固定30min
3 Y* d# A3 U$ Y6 \6 n% A 3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟
; l( O; u& n. o, G 4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次
; S: I: F! c# C# S' E& H. W2 X 5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板）
7 e. d# M8 R9 h4 x( V6 N/ ~& v文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
6 [3 M# c- h+ b7 F- x  I$ w* g不知道问题出现在哪呢？很急。。。# S, z" L0 ?0 b- U& e
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; B& c! Q, K$ N3 t+ Q
成骨：
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诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节9 X4 Q. o8 I9 o1 l( ~9 [( L2 B- F
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茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤
9 r( n, H5 U8 P: h. k6 n% x染色步骤：5 q5 W1 f8 u# C. j
1. 弃去培养基，用PBS清洗
+ M8 e& |1 u% m) h- W* ^, `$ z 2. 4%多聚甲醛固定30min3 D. K; R: a* w# ^$ Z1 D( s; c5 u
3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟; u& T& m% n" n/ _5 I5 A
4. PBS清洗2次
* P( \, d* ^" ^! V 5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）
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显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？9 i/ j# l5 P7 ?( }# ^' ]/ O; e
) e4 H1 N. B/ d6 k! y! H
向各位前辈赐教。。。
( D! M( W9 U7 s另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢

yaolutian

回复 light_blue 的帖子: |) A% q" a: `$ N
! o. J' J0 x/ p, b4 @" S
您好，请问调ph是用氨水吗，还是NaOH就行

light_blue

以下建议：! {# H0 p% y4 ]5 }
1.成脂诱导在异丙醇加入之前就能看到是否有脂滴着色，很明显。
$ s3 e( s( _! k9 N9 o2.成骨诱导如果用双蒸水配置茜素红需要调ph4.1~4.3。

leaderhou

我做的成骨和成脂染色都挺好的呀5 q; `* k5 K; e/ e) X! J4 T
成脂染色时候4%多聚甲醛固定15min，去除多聚甲醛后最好用异丙醇浸润2次，稍微晾干。油红染色后异丙醇我们没有清洗那么多次，直接用三蒸水或者PBS（延缓脂肪滴破裂）观察照相  h# \6 |6 ^' g3 H, G
成骨染色0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，5min-10min
, @3 E% T. \6 l" E0 S祝实验顺利