求助：MSC成骨成脂分化染色问题

龟酱

! I0 v0 d5 U! Z7 t5 U$ {/ l) q5 z3 `/ w! Y
成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。  z7 P+ b  E4 z2 O3 j/ ?' t2 b% y
用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基. x  l) U/ W+ P6 V
成脂：; R" |/ |) L9 F8 E) A
成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象1 O! Z# q2 ]  j, ]+ `
染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤+ p* T0 v# t6 |  T  x
染色步骤：  k/ X2 a9 q5 Z. K5 R
1. 弃去培养基，用PBS清洗
8 {/ {) @$ |# V8 M1 I. u. R 2. 4%多聚甲醛固定30min* f4 m8 B, T! J/ {, i/ a6 L
3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟
( ^8 h- J9 D  U+ V# R' v6 r$ t 4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次
4 o4 b1 \2 b- ] 5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板）
9 Y7 s+ |6 G: d* H8 B文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
& f+ @9 Q: }" p3 \1 A! A/ Q不知道问题出现在哪呢？很急。。。$ O* u- I4 a( `1 e' @/ I& ~

+ h1 v5 a7 v! L: ^+ j. @, L
1 N. O9 i: S! v成骨：
5 P4 }& F  L5 R3 j, \% `* j; G5 z% Q: {- w+ s5 p: e7 H; j9 k
诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节
( G+ R6 ^! ^5 ~9 a! w( s. M6 e3 Z
% Z  D% I' L& K+ [; z& r茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤5 k, a# F! ~0 G1 o3 O# N" G
染色步骤：
" O& I; Y( z& [( E) L 1. 弃去培养基，用PBS清洗
( j0 `6 I8 y; v3 \4 F! }" Y 2. 4%多聚甲醛固定30min( v3 S) S) s% ]+ M4 x
3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟5 f! O# {' N8 h7 B9 Z, z; @4 ?
4. PBS清洗2次
+ e8 }' Q8 D$ ? 5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）
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' ?4 Y$ g1 p8 `, Z8 Q显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？- C! _- g* N0 X8 \4 r6 Z3 L& L8 J
5 `* {. j: Q- n. w: l6 H' P
向各位前辈赐教。。。
/ D# w7 e" }' c: \' Y( S3 x/ V另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢

leaderhou

我做的成骨和成脂染色都挺好的呀# W: ^1 x- ~0 I" O
成脂染色时候4%多聚甲醛固定15min，去除多聚甲醛后最好用异丙醇浸润2次，稍微晾干。油红染色后异丙醇我们没有清洗那么多次，直接用三蒸水或者PBS（延缓脂肪滴破裂）观察照相
( \/ B+ @: V* d+ ]% s) M成骨染色0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，5min-10min( n" _  S0 U6 `  a) {  R
祝实验顺利

light_blue

以下建议：! T0 y+ N5 Q- P7 F6 q% D
1.成脂诱导在异丙醇加入之前就能看到是否有脂滴着色，很明显。
6 Q* q% @4 N8 M# M2.成骨诱导如果用双蒸水配置茜素红需要调ph4.1~4.3。

yaolutian

回复 light_blue 的帖子2 I0 r/ X) @0 z0 ?1 U

7 c$ R) h8 P1 [: ?9 ^  B: d您好，请问调ph是用氨水吗，还是NaOH就行