求教关于CIK细胞分离及培养相关问题

bin

各位同行，因为公司最近开展一个DC-CIK细胞的项目，需要我学会CIK细胞的分离培养方法，我试了两次，效果都不怎么样，因此我有几个问题向各位请教：1，血液分离以前需不需要先分离血浆和血细胞，是把血细胞先分离后再从中分离出单核细胞呢，还是全血直接离心分离单核细胞，在这个离心过程中需要注意什么细节？2，淋巴细胞分离液是选用哪个牌子的？分离前需要先预温吗？分离液开封后在4度环境中能保存多久不变质，影响分离效果？3，我用淋巴细胞分离液离心后，血浆层，单核细胞层，分离液层没有明显分层，这个可能的原因是什么？怎么解决？4，DC及CIK培养过程中使用的细胞因子，可以购买医院里面的注射液再稀释使用吗？大家认同的品牌有哪些？常用工作浓度是多少？细胞因子稀释后能放在4度冰箱保存吗？5，CIK细胞在做流式检测时，为什么会出现CD3阳性率特别低的情况，CD56阳性率有90%以上，而CD3阳性率只有5%一下，有谁能帮我解释其中的原因吗？
( k4 M- R* Q/ ^* u( P- S淋巴细胞分离培养是一个非常注重细节的实验，我提出的5个问题是我在实验过程中遇到的问题，在此仅起抛砖引玉的作用，希望各位同行能相互讨论，祝大家学业，工作顺利！

wagumaxida

, N2 q( K, l" e. P" j
' r& y8 S/ n. O4 [. W9 w1.一般不用先分离血浆和红细胞，直接全血
% `: A% d, Q$ f+ j  @! b, j# v2.一般用ficoll，国产的也可以，常温就行，因为温度会影响分离效果，不同温度分离液的密度会变化，具体可参考说明书
& ?0 S, c. G+ z' z3.原因可能：分离转速不够，分离液温度过高或过低导致分离液密度变化，加入血的时候破坏了界膜，分离液过少6 M# {  A2 F- F$ E  s' C+ r. ^& U0 e
4.可以；品牌的话国内外均可，国外的比较稳定，国内批次间差异过大；常用工作浓度请参考培养着指南，一般是100μg；一般现用现配或者分装后冻存-20
; o, W# J2 M8 B7 O4 [5.正常，可能是刺激成熟的步骤出了问题，可以在添加tnf-α的同时加入超抗原. l! @7 W+ i: P9 }- g# u2 x! J
6.在下愚钝，不一定能帮到你，祝你顺利

伊诺强

针对分离效果，建议采用合适的转速，采用国外FICOLL，分离前全血可以先用盐水大概2倍稀释，分离效果会非常明显，离心完注意观察白膜层的位置，一般会有一圈贴在离心管壁上，注意吸下来。祝你成功！

伊诺强

还有一条非常重要，ficoll液分装在离心管后，在使用前一定记得高速离心后再使用，因为管壁上不免会有分离液残留（贴附或者蒸汽冷凝），会影响分离效果！祝你成功！

mtdj1314

全血直接离心分离单核细胞；一般使用FICOLL分离液就可以，一般不需要预温，温度对分离效果有影响，推荐参照说明书；分离分层不明显可能是转速不够，一般是50ml离心管，2000rpm；因子的话我们一般保存在负二十，使用时才拿出来。祝好运！

hankangbio206

1.先把血浆和血细胞进行分离，剩余的血细胞与生理盐水1:1混合
4 |, R: b- B+ O9 G: t- c2.分离液选择临床级别，有很多的品牌，按照1“1比例加入 上面的混合液，加的过程要慢
7 D) w% h5 J! u& V7 W0 [5 \$ B3，分离单核细胞的时候要设置离心机，转速升0降0，即可梯度分离7 o3 I, m& G3 O
4.一搬细胞因子放在4度 一个月没问题。

牵着蜗牛去散步

最好是先分离血浆和血细胞。离心机转速不能太快。

bin

回复 hankangbio206 的帖子7 [# f( U. j( r8 s! C

2 ^+ s/ D0 H  ^2 Y分离血浆的时候，需要用盐水稀释吗？我做过不稀释和1:1稀释的，2000转20分钟根本分不开细胞和血浆，你们怎么分离的。

bin

回复 牵着蜗牛去散步 的帖子# A& m2 m& S( Z1 G& Z- M  N

- J% m& x( e% J! e' i分离血浆的时候，需要用盐水稀释吗？我做过不稀释和1:1稀释的，2000转20分钟根本分不开细胞和血浆，你们怎么分离的。

xinquan15

1.需要分离血浆和血细胞，分离后血细胞用生理盐水稀释，稀释比例为全血：生理盐水=1:1；血浆灭活离心后可以在后续培养中按1％左右比例添加，培养效果不错，全血分离为血浆和血细胞可用700-900g离心力15-20min；
. Y* i' ]- R1 R! U2，淋巴细胞分离液品牌较多，如GE，索莱宝，天津灏阳等，4°取出要恢复到室温，一般洁净间为恒温很湿的环境，所以恢复就好，室温太高，会影响分离效果；4°保存1个月不会有影响；
% B. e' u; {' G% b3从以下几个方面考虑：) E) _* G' s2 a* o  K2 J
1）离心机性能，好的离心机是质量和效率的保证；2）降速是否平稳，除了设置还是和离心机性能有关；3）淋巴细胞分离液的品质和温度4）少数与血源质量相关；
6 ?. T' z! L. }7 v% `' j4，DC及CIK培养过程中使用的细胞因子，可以购买医院里面的注射液再稀释使用吗？大家认同的品牌有哪些？常用工作浓度是多少？6 R7 q8 b3 j+ i6 I4 d  l+ x
因子常规使用GM-CSF,IL-4,,TNF-α，抗CD3，CD28，IFN-γ，IL-1α等，目前多种国内的因子已经被应用，品牌和批间差异较大，您还是要多查文献，做预实验，找适合培养体系，保证质量，成本又低的最佳组合；因子稀释后如CD3可以在4°，多数推荐-20°保存，并且每次按需配置，避免反复冻融；% J, ?' |  o3 _+ B+ D! z# b
5，我这流式出现您说的这种情况较少，不再发表意见，一般绝大多数CD3阳性，倒是DC刚开始出现86高表达，一直没找到原因。
: a. ~9 d3 s. Q/ l  g6 r意见粗浅，期望大家多交流