求教关于CIK细胞分离及培养相关问题

bin

各位同行，因为公司最近开展一个DC-CIK细胞的项目，需要我学会CIK细胞的分离培养方法，我试了两次，效果都不怎么样，因此我有几个问题向各位请教：1，血液分离以前需不需要先分离血浆和血细胞，是把血细胞先分离后再从中分离出单核细胞呢，还是全血直接离心分离单核细胞，在这个离心过程中需要注意什么细节？2，淋巴细胞分离液是选用哪个牌子的？分离前需要先预温吗？分离液开封后在4度环境中能保存多久不变质，影响分离效果？3，我用淋巴细胞分离液离心后，血浆层，单核细胞层，分离液层没有明显分层，这个可能的原因是什么？怎么解决？4，DC及CIK培养过程中使用的细胞因子，可以购买医院里面的注射液再稀释使用吗？大家认同的品牌有哪些？常用工作浓度是多少？细胞因子稀释后能放在4度冰箱保存吗？5，CIK细胞在做流式检测时，为什么会出现CD3阳性率特别低的情况，CD56阳性率有90%以上，而CD3阳性率只有5%一下，有谁能帮我解释其中的原因吗？
! f& W3 Y0 k' M8 A: o1 d淋巴细胞分离培养是一个非常注重细节的实验，我提出的5个问题是我在实验过程中遇到的问题，在此仅起抛砖引玉的作用，希望各位同行能相互讨论，祝大家学业，工作顺利！

细胞海洋

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小梓莜

回复 hankangbio206 的帖子" Z1 S; X& R. q' J" W8 H! R; p# p

" {/ `8 {6 ]$ n4 N  x9 y/ G你好，看到你回复的帖子，想问下你的离心机是什么品牌的？如果转速升0降0，那分离一份PBMC需要多长时间？谢谢指导

rongrong12662

CIK细胞在做流式检测时，为什么会出现CD3阳性率特别低的情况，CD56阳性率有90%以上，而CD3阳性率只有5%一下9 s2 J3 m1 k$ `6 n; B# n
很可能是抗体孵育的时候标记错了，或者上样的时候顺序错了。一般cd3在90%以上，cd56结果较低，建议重新做一下

yanglixia

回复 bin 的帖子( }. a6 F/ _: R9 n2 j

8 @4 V2 S" V. ]- N分血浆不用稀释，要不血浆就不能用了，全血直接离心就行3000rpm10-15min1 ~( l* n/ v" H4 T- O$ I- ]5 ~- z. W

zhanglu8677

2000转20分还分不开血细胞跟血浆?每个离心管装的体积是多少毫升？降速调到0了吗？

meister

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3 }9 h3 l3 }( t& v9 d4 n# |$ ?8 j: U
是流式分析操作错误， 不会有以上结果。

lyj-0017

回复 bin 的帖子
; D- w- w) X3 n8 ~3 F9 o
5 g7 z. G' b" c) k- t' L前面的问题大家都说的挺多的了，至于第5条流式检测，你确定你的CD3和CD56阳性率没有弄颠倒？流式检测与很多因素有关，细胞培养好坏是一前提，细胞染色、上机检测参数设置、后续分析都有可能造成结果不理想，可否把过程说一下？

xinquan15

1.需要分离血浆和血细胞，分离后血细胞用生理盐水稀释，稀释比例为全血：生理盐水=1:1；血浆灭活离心后可以在后续培养中按1％左右比例添加，培养效果不错，全血分离为血浆和血细胞可用700-900g离心力15-20min；3 ^# i# f8 s, P% h# r
2，淋巴细胞分离液品牌较多，如GE，索莱宝，天津灏阳等，4°取出要恢复到室温，一般洁净间为恒温很湿的环境，所以恢复就好，室温太高，会影响分离效果；4°保存1个月不会有影响；2 [0 S1 h, N1 d$ o
3从以下几个方面考虑：
* H8 o" a6 X  e1 K1）离心机性能，好的离心机是质量和效率的保证；2）降速是否平稳，除了设置还是和离心机性能有关；3）淋巴细胞分离液的品质和温度4）少数与血源质量相关；8 e" v6 F/ g. L
4，DC及CIK培养过程中使用的细胞因子，可以购买医院里面的注射液再稀释使用吗？大家认同的品牌有哪些？常用工作浓度是多少？: r5 ]  i/ \9 @) g- b2 Y! P) T
因子常规使用GM-CSF,IL-4,,TNF-α，抗CD3，CD28，IFN-γ，IL-1α等，目前多种国内的因子已经被应用，品牌和批间差异较大，您还是要多查文献，做预实验，找适合培养体系，保证质量，成本又低的最佳组合；因子稀释后如CD3可以在4°，多数推荐-20°保存，并且每次按需配置，避免反复冻融；
6 L2 |6 P4 L7 V8 o5，我这流式出现您说的这种情况较少，不再发表意见，一般绝大多数CD3阳性，倒是DC刚开始出现86高表达，一直没找到原因。
9 f% q4 q; b, r/ c. F- Q/ g! N意见粗浅，期望大家多交流

bin

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. R# n7 e, {$ X2 z! E
$ l. A" b, V7 v. G# V分离血浆的时候，需要用盐水稀释吗？我做过不稀释和1:1稀释的，2000转20分钟根本分不开细胞和血浆，你们怎么分离的。