流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

# C% S4 ]1 f; C1 x' |
我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。4 [+ E0 p7 T( m- k" Q
先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

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, V- ^0 i- r  H. F/ k" y
( D# l; ?9 W$ L1 B细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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, m6 ?) x6 q1 |5 Y  V# [2 `( |* s% U! \0 C. q
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
$ o5 K( w$ q  R1 i9 eA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：! ?! J6 g- I" e, D$ D# F
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。! p! ~7 b% @5 r: }7 z! M, E7 l  T) e" y
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。( k' }8 I# U6 H) w
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
$ ~, Z) m( t2 {/ v% g(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。7 b) C# [- e$ B
这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
, m# F( r* P. h" z- D最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

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http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
  T! ^0 i5 k! O% ?% _2 F3 y; Q4 ~- DA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：% e. @- `- ], G. h  E3 e: c
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
* h/ Q) _  I5 ]7 m: u' l(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
  Q. n1 l3 {% r# v3 n(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
2 k' x4 Y9 d. R+ x  z& l- h(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。% e! u- |6 G7 ~/ ~; V

rocfield

回复 qing蓝qing 的帖子5 x& ]" p7 q8 N

9 `! K$ ~  S9 x& e1 `不知道您的这个流程是从哪里查到的？6 R: G2 }2 a! ^) {) e( i$ x: ^
我们做的大致是这样的：
9 F* Y) T& U! `8 ^& s# G7 i1：收集的细胞用PBS洗一次；
: j& f' v; a' q" E2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；9 c% S2 ~3 o7 J% a9 h
3 PBS洗两次
6 s& ^) y# R: ?7 f' _, c4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）' T6 }: f8 B: i2 x- A/ `, y
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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/ s  ^+ t: b' ?% c+ B
% Q9 H9 F! D8 L0 h% G7 V谢谢指教

shaozi402

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检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？