流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

  L7 L- N2 T( D: h3 Z% O5 R
我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
( Q# `4 b# c: U先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子1 C, `7 K2 H) {" d

( N) `+ A' L  o  [/ B+ n$ }- R细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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4 C: I- I. f; K* ~
  i1 U: V( v9 s' F$ h. d1 [# chttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 ; q* C' e8 x' G" k  n7 ]
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
$ @/ A9 O* {0 r9 e$ _9 y8 t(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。$ ?- ?; n: {4 s9 K
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
/ O0 e2 z1 u* X/ e5 Q0 l9 `4 c$ n1 Y4 K(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。% I& l) `0 j0 y$ ]
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。" l9 Z0 ]/ E- X5 \4 B; k' s$ |
这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
8 B/ N  Z( w* P: [6 s# h, g5 p最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

- g0 v, [0 M% z4 u7 r  Ihttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
3 D& x9 W5 h$ r! j: O/ aA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：" ?' ^/ A( |) v, ^- L) M2 B
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。* A% i0 Y1 N  I& d" C3 [% G, h
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
$ Y4 b/ K: m: w  w(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
+ R; I- K1 f4 v4 z(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。6 Q8 x* q) o5 Z' }

rocfield

回复 qing蓝qing 的帖子7 ~  m8 P9 P% M( Y

% H/ h: I0 V; k; `( n  |不知道您的这个流程是从哪里查到的？$ t0 Q( G: ~0 w1 O/ V: ]
我们做的大致是这样的：
) J- I  p# ]* V  M! [1：收集的细胞用PBS洗一次；
% a! d* k. v4 c! \8 D2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；
+ s/ w9 Q: R9 f# R3 PBS洗两次
+ R7 N/ A7 R+ @' v6 v0 h2 M9 C( Z4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）9 t' j1 O" }7 Q9 D$ l, d
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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0 F0 ^$ z/ Y5 C. W6 t- g5 x
4 e  E, W- D! X5 L4 C0 ~: S谢谢指教

shaozi402

回复 rocfield 的帖子) G% |" H' s! ~5 K* H5 Y

9 ?) b: M3 _: t0 x& p* b检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？