流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

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我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
; V5 |' T: ^' F$ f: u* W先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子% H8 C2 Q; m6 ^. H" m. V" b
+ o- A- O" Q! T) o. E
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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7 X2 h% c9 u  y* l. E
/ i  }9 g9 E0 {2 \0 u8 ]8 shttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 2 C( Z1 V' X2 I; b5 k, W
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：( m! I9 L& {" t) @0 q
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
. T2 G# L/ Z" r, C6 S7 g+ j(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。$ {% s0 J& ?  F+ P) \6 H1 ~) }
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。, F5 k( p3 n4 B9 N$ s3 h
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
- Q5 W! b4 r5 [3 F: Z这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
  t* n6 ~) E  f! V, Q最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

6 Q# z9 m# P2 x7 p( Ohttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
" C1 w  n4 a$ ^- pA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
) t# X9 K! J: q4 h" b; e! s(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。9 L. o/ a" x& V# R5 a( O0 c
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
6 N' h' t' Q1 U# k6 B! p$ t& @" J(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
1 y3 U7 M: u# d0 N& {8 q+ K0 I(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。  _0 f- t  \8 g

rocfield

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6 B& J& K& T8 O
7 m/ w1 v0 H5 }3 V3 u' G6 t3 H6 K不知道您的这个流程是从哪里查到的？
0 j+ m( ~% F, E6 z! f% |0 ^我们做的大致是这样的：
- A) J0 r; `- h1：收集的细胞用PBS洗一次；/ g* ^4 T- d" [9 b2 K& F. {
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；
  E1 x2 I" X6 a4 I3 g! Y% _3 PBS洗两次4 d6 j* Y& j, A2 r! c+ I; |
4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）
8 I% E. t8 G7 E: ?" [1 V8 V) ^- i如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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; i: Y+ b1 E& d) R" }' J, W+ X- f0 n, g' h+ w& h- l7 e& e! W, _- h2 N
谢谢指教

shaozi402

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9 u! ^. l- K5 i9 ]: z: c9 D+ C! V0 ]! N, O7 _2 L
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？