流式分选后继续培养细胞

dwfrost

我最近做GFP转染实验（用的lipo2000），将含GFP的质粒转染到细胞之后，第二天用流式分选GFP阳性细胞（阳性率大概3%），想继续养分选后的细胞，但过一天再看时细胞都没有贴壁的。我怀疑是流式对细胞损伤太大了！因为做分选的老师收到的反馈很多都是不贴壁的。请问有人做过分选后培养细胞吗？能分享一下成功的经验么

avbn

学习中，我也想知道

hyde

收集管里面血清浓度提高一点？- {* g6 ~0 K. R1 a
收集管里面收集用的缓冲液液面够高吗，如果打出来的细胞挂在壁上，没有缓冲液会挂的。

dwfrost

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分选前盛细胞的培养液是无血清的，收集管中是正常的含血清的MEF培养液，是不是有浓度差就ok了？收集管规格是5ml，收集管中培养液是4ml，这个应该没问题。

青云之上

分选后再培养我们做的虽然跟你不是同一个细胞，但是培养还是没有问题的，第一个，你要注意机器的无菌，分选前头一天酒精泡鞘液桶和蒸馏水桶，房间紫外灭菌，当天机器无菌管路制备；第二个，阳性细胞比例不高，你要确保你细胞数量足够，否则分选出来细胞培养确实不好养，因为，分选的过程对细胞会有损伤，太少的话不足以弥补损伤；第三个，收集管要有培养基，我看你说有，这个应该没有问题，但是没有培养基的部分，管壁一定要用培养基润湿，分选时，细胞会打在管壁上；第四个，温度，机器温度在分选时要设置在4℃；第五个，你转然后第二天就分选，这个过程你要确定好是否转染成功，而且转染后细胞状态是否良好，分选后细胞状态不好到底是转染本身的问题还是分选造成的，你得确定好。

mrhighly

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dwfrost

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1.我们这边做流式是有专门的老师操作的，她也说是无菌操作，但我问了分选后成功贴壁的只有肿瘤细胞。
& ]2 Q8 ~; K' F) E2.阳性率这个是低了点，成纤维细胞不像ES，转染效率是比较低，机器显示最后得到的细胞数是3万多个，我后来就养到24孔里边的。结果离心可能没完全离下来，重悬后的细胞特别少，估计就上千个。5 T. }' y7 q, h' v( m. [
3.“润湿”这个没注意，谢谢你的提醒。% C% B" i7 {, M" Q3 U# U8 a
4.分选前后细胞是放在冰盒上的，至于机器温度，我再问问。0 j$ E6 b7 [7 J) a4 u! ^2 U; E# N6 v: c
5.分选前是镜检过的，有GFP阳性细胞，虽然不多，但可以确定是有的。细胞状态是贴壁状态的，看着还好。和今天飘起来的比，简直太明显了。

hyde

回复 dwfrost 的帖子. B4 Z1 o0 @: N4 _

" H  U3 F2 c3 _7 ]# x3 x分选前我们就用带血清的了，不知道你的细胞加血清会如何？

shaozi402

可以活，但不是每一批都能活的

dwfrost

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! c# W. k8 P. t# p6 `  o6 s
9 @! |  \' i+ T) J/ B7 ?) c, M我做过两次了，最后都漂起来了，纠结中……